痘病毒编码的泛素连接酶功能蛋白综述,病毒学论文

痘病毒编码的泛素连接酶功能蛋白综述,病毒学论文痘病毒科〔Poxviridae〕病毒是在细胞质中复制的双链DNA病毒，大约编码200多种蛋白质。该科分为两个亚科：脊椎动物痘病毒亚科〔Chor-dopoxvirinae〕和昆虫痘病毒亚科〔Entomopoxviri-nae〕。脊椎动物痘病毒亚科包含八个属[1].很多病毒在进化经过中构成了有利于本身的操纵和调控宿主泛素〔ubiquitin,Ub〕系统的机制。它们能够编码泛素连接酶和去泛素化酶，也能劫持泛素化系统的组件去靶向一些细胞的成分[2-3].除此之外，病毒能够将泛素化作为一种可逆的翻译后修饰经过，用有限的病毒蛋白质来履行更多的生物功能。例如，人免疫缺陷病毒Gag蛋白[4]和埃博拉病毒VP40蛋白[5]因病毒粒子的出芽和释放而被泛素化，流感病毒NP蛋白的泛素化和去泛素化与病毒复制有关[6].另外，宿主细胞能够将某些病毒蛋白的泛素化作为限制病毒增殖的机制，如黄病毒NS5蛋白[7]或人乳头状病病毒E7蛋白[8].痘病毒同样也有调控Ub系统的多个机制[9-10],它们能够编码自个的Ub连接酶，或者直接抑制细胞E3连接酶的功能，如A49或PACR[11-12].除此之外，对痘苗病毒的研究表示清楚病毒完成一个生命周期需要活性蛋白酶体[13].泛素化是一种翻译后修饰经过，包括一个高度保守的8kuUb与受体蛋白的共价连接。这个经过至少包括一个高度保守的三酶级联〔E1-E2-E3〕反响，即需要E1活化酶活化泛素，随后转移泛素到E2泛素结合酶，再通过E3泛素连接酶将活化泛素转移到蛋白质底物。E3泛素连接酶决定靶标蛋白的特异性[14].迄今为止，发现鉴定的E3连接酶能够分为五大类。第一类为HECT构造域家族蛋白质；第二类包括c-Cbl、Mdm2、凋亡蛋白抑制因子以及其他包含RINGfinger构造域的蛋白质，这类连接酶的单个多肽链中通常既包含E2结合域，也包含底物辨别基序；第三类E3连接酶由大蛋白质复合物组成，其包含一个由cullin和RING-CH异二聚体组成的最小的连接酶核心构件，比方SCF、APC和VBC复合物；第四类为U-box蛋白家族；第五类被称为膜相关RING-CH〔membrane-associatedRING-CH,MARCH〕蛋白，它的氨基末端包含一个RING-CH构造域，其后紧随着两个跨膜构造域[15].本文主要对当下已经发现并鉴定的痘病毒编码的泛素连接酶功能蛋白进行综述，以促进对痘病毒与宿主泛素系统互相作用机制的进一步深切进入研究。1痘病毒编码的E3泛素连接酶功能蛋白痘病毒编码很多具有内在活性的泛素连接酶，包括膜相关RING-CH〔MARCH〕构造域蛋白、p28/ReallyInterestingNewGene〔RING〕finger蛋白、锚蛋白重复序列〔Ankyrinrepeats,ANK〕/F-box蛋白、Bric-a-BracTramtrackBroadcomplex〔BTB〕/Kelch亚蛋白及APC家族蛋白等。迄今发现的痘病毒编码的E3泛素连接酶见表1.1.1痘病毒编码的MARCHE3泛素连接酶病毒编码的MARCHE3泛素连接酶的一个特点是其氨基端存在RING-CHfinger构造域，后面通常紧跟着两个跨膜构造域。这一蛋白家族普遍被称为MARCH蛋白。痘病毒的MARCHE3泛素连接酶的模型见图1A.黏液瘤病毒〔myxomavirus,MV〕编码的含RING-CH的蛋白M153R是病毒早期表示出的毒力因子，在瞬时转染的细胞中定位于内质网和高尔基体反面网状构造[16].M153R能够下调宿主细胞外表MHC-1类分子、促凋亡因子CD95〔Fas〕和白细胞活化黏附因子〔activatedleukocytecelladhesionmolecule,ALCAM〕的表示出[17].M153R还具有抑制CD4分子的作用，类似于其对MHC-1类分子的作用[31].在MV感染经过中，M153的RING-CH构造域作为泛素连接酶，辨别CD4尾部的赖氨酸残基，使CD4的胞质尾泛素化，再通过内吞作用和随后溶酶体的降解导致其内化。M153R诱导的细胞外表免疫分子的泛素化和降解，是MV抑制免疫应答的一个重要机制。1.2痘病毒编码的p28/RINGfinger蛋白正痘病毒属成员鼠痘病毒〔ectromeliavirus,EV〕编码的一个28ku的蛋白质〔p28-RING蛋白〕是一种具有RINGfinger泛素连接酶活性的重要的毒力和抗凋亡因子[18],在病毒感染早期和晚期均有表示出。其他正痘病毒属成员中也鉴定出了p28-RING蛋白的同源物，如天花病毒〔Variolavirus,VARV〕、牛痘病毒〔cowpoxvirus,CPXV〕、猴痘病毒〔monkeypoxvirus,MPXV〕和痘苗病毒〔vacciniavirus,VV〕IHDW株等[32].在兔痘病毒属的2个成员兔纤维瘤病毒〔shopefibromavirus,SFV〕和MV的基因组中也发现了与p28-RING蛋白同源的蛋白[19,31],鸡痘病毒基因组内也存在10个与p28-RING蛋白具有同源性的ORFs[21].p28蛋白包含两个功能构造域：C末端RINGzincfinger构造域和N末端KilA-NDNA结合域〔图1B〕。研究证明，在病毒感染经过中，p28被泛素化，与共轭泛素共定位于被称为病毒工厂的病毒复制的细胞质区域。p28的泛素连接酶活性依靠其C末端的RINGfinger构造域，RINGfinger域缺失或突变，能使其丧失泛素连接酶活性[19-20,33].在很多大DNA病毒以及细菌和噬菌体中也发现了KilA-NDNA结合域[34].p28在病毒工厂的定位依靠KilA-NDNA结合域[35].有趣的是，在鸡痘病毒〔fowlpoxvirus,FWPV〕编码的8个KilA-N蛋白和金丝雀痘病毒编码的23个KilA-N蛋白中，只要两个与RING构造域配对，其余的KilA-N构造域与未知功能域相关，或是KilA-N-only域，这些蛋白质的功能当前尚不清楚[36].体外泛素化检测表示清楚，VV-IHDW株和VARV的p28同源物也具有泛素连接酶的功能，VARV的p28同源物D4R在体外与泛素结合酶Ubc4和UbcH5c一起发挥作用[19,33].有些痘病毒编码的p28同源物与p28的亲缘关系较远，如黏液瘤病毒编码的M143R、禽痘病毒编码的FWPV150和FWPV157.尽管这些蛋白质与p28的序列类似性较低，但对泛素连接酶功能至关重要的半胱氨酸和组氨酸残基却是高度保守的，且KILA-N构造域的关乎DNA结合的关键残基44-51残基也很类似。研究证明，M143R、FPV150和FWPV157也在感染期间被泛素化，并与结合泛素共定位于病毒工厂[21],讲明p28及其同源物的功能在痘病毒家族的成员之间是高度保守的。像很多细胞泛素连接酶一样，p28在病毒感染经过中遭到蛋白酶体降解和泛素化的严格调控，还可通过本身泛素化进行自我调节[20].p28及其同源物能催化构成赖氨酸-63〔K63〕和赖氨酸-48〔K48〕连接的泛素链，通过-K48构成的泛素链与蛋白酶体降解靶蛋白的作用相关，而-K63链充当介导信号转导的支架，或改变靶蛋白的亚细胞定位。能够揣测，p28及其同源物在病毒的感染经过中可能发挥着较为复杂的生物功能。已经有研究表示清楚，在鼠痘病毒感染的经过中，p28介入抑制病毒感染诱导的细胞凋亡，进而促进病毒复制[37].另外，p28及其同源物在先于病毒工厂构成的感染早期也有表示出，表示清楚早期的p28可能泛素化其他蛋白质[21].由于p28及其同源物定位于病毒工厂，所以病毒工厂中很可能存在潜在底物。固然在说明p28及其同源物的E3泛素连接酶活性，以及其与病毒体外复制和体内逃避宿主的抗病毒效应之间的联络等方面获得了宏大的进展，但还有很多问题需要进一步研究。例如其宿主的和/或病毒的靶标底物的特性和数量、调控其催化活性的机制以及抗凋亡反响的机制尚不清楚。1.3痘病毒的APC家族E3泛素连接酶后期促进复合物〔anaphase-promotingcom-plex,APC〕或细胞周期体是已经知道最大的细胞泛素连接酶复合物，至少由12亚基组成〔图1C〕.APC催化泛素连接到分离酶抑制蛋白和有丝分裂细胞周期蛋白的赖氨酸侧链[38].APC的亚基APC2〔cullin家族的远亲成员〕和APC11〔一个RING-H2finger蛋白〕组成APC的最基本的泛素连接酶组件[39].近期的研究发现，痘病毒的RING-finger蛋白家族与APC11的RING构造域有类似的序列。如鳄鱼痘病毒〔crocodilepoxvirus,CRV〕CRV047蛋白[40]、传染性软疣病毒〔molluscumcontagiosumvi-rus,MOCV〕MC026L蛋白[41]、羊口疮病毒〔conta-giouspustulardermatitisvirus,ORFV〕PACR蛋白[12].这些痘病毒蛋白质都包含一个类似于APC11的RING-H2基序修饰的RING-finger构造域。ORFVPACR〔痘病毒的APC/细胞周期调节器〕是迄今研究的唯一的APC11同源物。PACR被证明能与APC亚基APC2、APC3和APC4共沉淀，并且以与APC11一样的方式与APC复合物互相连接。然而，序列分析发现，PACR和其他痘病毒PACR同源物包含能抑制E2泛素结合酶结合到复合物的RING构造域的突变，进而抑制底物泛素化。APC的抑制可促进细胞进入S期，细胞周期的这一阶段可能存在另外的有助于病毒复制的细胞因子。另外，APC的两个靶标，即细胞的核糖核苷酸复原酶和胸苷激酶蛋白，在DNA合成所需的游离核苷酸池发挥作用。痘病毒通常编码本身的胸苷激酶和核糖核苷酸复原酶基因，然而，病毒胸苷激酶和核糖核苷酸复原酶基因在ORFV以及其他编码PARC同源物的病毒中不存在。与此相反，很多缺乏PACR同源基因的病毒编码本身胸苷激酶基因。揣测编码APC抑制剂的主要原因之一就是上调细胞胸苷激酶和核糖核苷酸复原酶基因，以弥补游离核苷酸池功能的缺陷[12].这些病毒蛋白质在E3泛素连接酶复合物的构成和调控中的功能仍需进一步研究。1.4痘病毒编码的ANK/F-box蛋白锚蛋白重复序列和F-box构造域蛋白是痘病毒编码的大分子蛋白质家族之一，大小在400~650个氨基酸之间，其N-末端有5~10个ANK重复序列，C-末端包含与F-box构造域相类似的保守序列，具有将底物募集到细胞SCF〔SKP-1、cullin、F-box〕泛素连接酶复合物上的功能[42]〔图1D〕。痘病毒的F-box样构造域后来被命名为PRANC〔poxproteinrepeatsofankyrin-Cterminal,PRANC〕.很多痘病毒编码ANK/PRANC蛋白。对黏液瘤病毒的研究初次发现了痘病毒ANK/PRANC蛋白与SCF复合体之间的互相作用。MT-5是黏液瘤病毒编码的4个ANK/PRANC蛋白〔M-T5、M148、M149、M150〕的华而不实之一，其N末端有7个ANK重复序列构造域，C末端有1个F-box基序，与cullin-1共定位于细胞核，调节细胞周期和与Akt蛋白的互相作用[22-23].黏液瘤病毒编码的这4个ANK/PRANC蛋白都在病毒的毒力中发挥作用，缺乏所有的ANK/PRANC蛋白的重组黏液瘤病毒促进了细胞的多种抗病毒通路，毒力极大减弱[24,43].M150的N-末端有9个的ANK重复序列，C-末端有一个F-box构造域，是细胞SCF复合物的一部分，与核转录因子B〔NF-B〕的p65亚基共定位于细胞核，表示清楚M150牵涉对NF-B的抑制[44].M148蛋白有10个ANK重复序列，定位在细胞质和细胞核中。M149蛋白中有9个ANK重复序列，以点状形式均匀分布在细胞质中。病毒在培养的细胞中的增殖都不需要M148和M149蛋白，但它们却都是MV感染家兔的毒力因子[24].M148、M149和M150的结合伴侣和潜在的目的底物尚不清楚。体外泛素化测定证明羊口疮病毒编码的5个ANK/PRANC蛋白均与SCF泛素连接酶复合物的功能相关[26].同样，鼠痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒蛋白的F-box构造域也是与SCF复合体互相作用所必不可少的[25,27,45].鼠痘病毒编码的4个ANK/PRANC蛋白〔EVM002、EVM005、EVM154、EVM165〕靶向SCF阻止NF-B抑制剂IB的降解，抑制NF-B的核转运[27].牛痘病毒编码的ANK/PRANC蛋白CP77是一个宿主范围蛋白，与NF-B转录因子p65互相作用，抑制炎性细胞因子的转录[45].利用酵母双杂交挑选，发现天花病毒编码的G1RANK/PRANC蛋白与NF-B调节蛋白NFB1/p105以及SKP1有关联。G1R及其牛痘病毒、猴痘病毒和鼠痘病毒的G1R同源物〔CPXV006、MPXV003、EVM002〕都能结合p105,并在TNF刺激后，抑制G1R的降解[46].除此之外，CPXV006缺失病毒在培养的细胞中显示出促炎细胞因子释放的增加，并且感染C57BL/6小鼠后，毒力稍微减弱[47].总之，痘病毒很可能利用这些ANK/PRANC蛋白为SCF1泛素连接酶招募新的靶蛋白，并利用宿主的泛素-蛋白酶机制降解特异的细胞〔可以能是病毒的〕蛋白质以帮助病毒复制。痘病毒ANK/PRANC蛋白对NF-B信号通路的调控似乎是一个共同的趋势。1.5痘病毒编码的BTB/Kelch〔BBK〕蛋白BTB〔Bric-a-BracTramtrackBroadcomplex,BTB〕构造域是一个高度保守的蛋白-蛋白互相作用基序，牵涉很多细胞功能。BTB蛋白的BTB构造域与cullin-3和kelch、MATH或ZincFingers等底物招募域连接，介导依靠cullin-3的泛素连接酶复合物的cullin与底物的结合，使靶蛋白泛素化[48]〔图1E〕。痘病毒是已经知道的唯一编码BTB-BACK-Kelch〔BBK〕蛋白的病毒家族。例如，痘苗病毒编码3个BBK蛋白[49];牛痘病毒编码6个BBK蛋白[50];鼠痘病毒株Moscow株〔EVM〕编码4个BBK蛋白[51];猴痘病毒只编码一个BBK蛋白[52].鼠痘病毒编码的BTB/kelch蛋白EVM150和EVM167的BTB构造域是与cullin-3连接所必需的；EVM150和EVM167与共轭泛素、Roc1互相作用，Roc1是一个有活性的cullin-3泛素连接酶复合物所必需的RING-finger蛋白[28].新近的研究表示清楚，EVM150能够抑制宿主的NF-B通路，且其作为cullin-3泛素连接酶复合物的适配器的功能并不依靠它的kelch构造域[53].有证据表示清楚在痘病毒的生命周期中BBK蛋白具有重要作用。缺乏BTB/kelch蛋白C2L、F3L或A55R的痘苗病毒皮下注射小鼠模型后，发病机制发生改变，但是它们在宿主细胞泛素通路中的作用仍不清楚[54-56].缺失BTB/kelch基因D11L、C18L、G3L和A57R的牛痘病毒GRI-90株，也导致宿主范围改变和毒力减弱[29].另据报道，绵羊痘病毒的BBK蛋白SPPV-019是一个重要的毒力因子。利用SPPV-01