生物制药酶工程和手性药物培训课件

生物制药酶工程和手性药物手性是自然界的基本属性宇宙是非对称的，如果把构成太阳系的全部物体置于一面跟随着它们的镜子面前，镜子中的影像不能和实体重合。……生命由非对称作用所主宰。我能预见，所有生物物种在其结构上、在其外部形态上，究其本源都是宇宙非对称性的产物。LouisPasteur法国化学家巴斯顿2生物制药酶工程和手性药物3手性(Chirality)：自然界的基本属性组成生命活动的基本化学物质是手性化合物！手性药物：一把钥匙开一把锁！氨基酸---蛋白质糖---多糖核酸---DNA2/3以上开发中的药物为手性市场上40%的手性药物为单一异构体2002年全球手性药物市场1590亿美元生物制药酶工程和手性药物手性(chirality)这个词来源于希腊字“手”(cheir)。

手是手性的—右手与左手成镜像。手性是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称为手性物体。手性4生物制药酶工程和手性药物从天文学到地球科学，从化学到生物学，几乎处处都有手性显身影。5生物制药酶工程和手性药物太阳系的所有天体（包括小行星）都是按照右旋方向旋转的，称为右手定则。6生物制药酶工程和手性药物2000年8月发生于大西洋的阿尔贝托飓风，其螺旋具有手性特征。7生物制药酶工程和手性药物在植物学中，手性也是一个重要的形态特征。绝大部分攀缘植物是沿着主干往右缠绕的，但也有少部分是往左缠绕的，如香忍冬。左手性紫藤右手性多花紫藤8生物制药酶工程和手性药物9生物制药酶工程和手性药物长瓣兜兰：花两侧长瓣的螺旋是左右对称的，右侧是左旋，左侧是右旋——《科学》2002,Vol.54,No.5510生物制药酶工程和手性药物2002年6月13日，英国《自然》周刊发表加拿大科学家杰森（L.Jesson）和巴雷特（S.Barrett）研究某植物花柱手性的论文，指出两个等位基因中的一个控制花柱的左右，其中向右是显性的。11生物制药酶工程和手性药物12

虽然产生这种手性的确切机理、起源和过程仍是科学上的未解之谜，但有一点是明确的：这些分子的作用以至于生命过程均与手性有关。对映体的不同生理性质是由于它们的分子的立体结构在生物体内引起不同的分子识别造成的这个现象称为“手性识别”。这种识别可比喻为手与手套的关系，右手能套进右手套，而左手就套不进右手套。手套与左右手的相互关系生物制药酶工程和手性药物有机分子手征性的发现1848年，法国化学家巴斯顿（L.Pasteur,1822～1895）发现酒石酸两种不同的存在形式：

左旋酒石酸

右旋酒石酸图：巴斯顿把酒石酸晶体分开成两个镜像异构体13生物制药酶工程和手性药物DNA在生命的产生、演变、进化这样漫长的过程中，自然界造就了许多分子，手性分子占去了很大的比例。构成蛋白质的氨基酸都是L型氨基酸，多糖和核酸的单糖是D型糖。人们甚至发现，1969年坠落在澳大利亚默奇森的陨石中的氨基酸也主要是L型的。生物分子手性同一性14生物制药酶工程和手性药物152001年诺贝尔奖：不对称催化从实验室到工厂（1984）生物制药酶工程和手性药物孟山都公司的L-多巴生产工艺第一例工业化成功的催化不对称反应（1970’S）治疗帕金森病16生物制药酶工程和手性药物(S)-Metolachlor(Novatis,1996)不对称合成最大的工业化例子（>10,000吨/年）material amountMEA-imine 10,000Kg [Ir(COD)Cl2]2

34gLigand 68gNaI 92gH2SO4 250gH.U.Blaser,ASC2002,344,17除草剂17生物制药酶工程和手性药物九寨风光水相不对称催化反应18生物制药酶工程和手性药物生物催化反应19生物制药酶工程和手性药物酶催化20生物制药酶工程和手性药物树状分子酶Dendrizyme外层区内层区

核心21生物制药酶工程和手性药物22已用于工业的不对称催化反应生物制药酶工程和手性药物获得手性化合物的不同途径拆分和或或手性池前手性化合物天然手性化合物消旋化合物催化不对称合成23生物制药酶工程和手性药物24手性与手性药物化合物的活性关系以及表现出的错综复杂的药代动力学和药效学特征

在许多情况下，化合物的一对对映体在生物体内的药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著的差异。 使用单一对映体的必要性只有一种对映体具有所要求的药理活性， (++)或(+)

而另一种对映体则没有显著的药理作用；(2)一对对映体中的两个化合物都有等同的或 (--)

近乎等同的定性和定量的药理活性；两种对映体具有定量上等同，但定性上不同的活性； (+)或(++)(4) 各种对映体具有定量上不同的活性； (+)或(-)

人体的手性环境和特异的对映体相互作用，导致手性药物对映体药代动力学和药效学的立体选择性(stereoselectivity)差异，使临床应用手性药物出现复杂性。1.吸收 2.分布 3.代谢 4.排泄生物制药酶工程和手性药物25

这种差异的例子很多。治疗哮喘病的沙丁胺醇就是一例。它的有效对映体的药理活性要比另一对映体的大80倍。又例如，L-多巴是治疗帕金森症的药物，作为“前药”摄入病人体内，再由体内的酶将多巴转化为具有药理作用的多巴胺。由于人体内的酶对该“前药”多巴是专一性的，只有左旋的L-多巴胺被酶所转化，因此，服用消旋的多巴的话，右旋多巴不被酶所转化，日积月累在人体内沉淀下来，势必对病人造成新的危害。如果手性药物的两个对映体的药理活性相当，它们的毒副作用无差别，那就没有必要服用单一对映体的药了。(-)-(R)-沙丁胺醇(-)-L-多巴盖替沙星生物制药酶工程和手性药物26(Timolol)是已知作用最强的b-肾上腺素受体阻断剂，作用强度为普萘洛尔(propranolol)的8倍，临床用于治疗高血压、心绞痛、青光眼等。特别对于原发性开角型青光眼有良好的效果，优于传统的降眼压药。目前临床使用的是(S)-(-)-Timolo对映体滴眼液，对于哮喘病人禁用，长期持续使用则会引起较为严重的副作用甚至致命。(R)-(+)-Timolo对映体在动物实验上其对b-肾上腺素受体阻断作用小于(S)-(-)-Timolol对映体，但是在降低眼压方面其作用减少的不多。(S)-(-)-Timolol对映体的b2受体阻断作用是(R)-(+)-Timolol对映体的49倍，其收缩支气管的作用是(R)-(+)-Timolol对映体的13倍，但其降低眼压的作用仅为(R)-(+)-Timolol对映体的4倍。因而(R)-(+)-Timolol对映体有可能成为比(S)-(-)-Timolol更为安全的、更少全身副作用的治疗青光眼的手性药物。

(R)-(+)-Timolol (S)-(-)-Timolol生物制药酶工程和手性药物27(S)-普萘洛尔,98倍 (S)-萘普生,

35

倍 (S)-奥美拉唑L-多巴 右异环磷酰胺(dexifosfamide) 盖替沙星抗肿瘤药生物制药酶工程和手性药物28

盐酸舍曲林 (-)-酒石酸左啡诺 右旋雷佐生

(镇痛剂，比吗啡强5倍)(减轻毒副作用)(+)(1R,3S)>(-)(1S,3R)Azasetron 罗格列酮

30倍

(5HTa受体拮抗剂) TetrahedronLett.,2002,43,4951生物制药酶工程和手性药物29生物制药酶工程和手性药物30手性药物政策与市场情况

近年来许多国家的药政部门对手性药物的开发、专利申请及注册，开始作出相应的规定。美国食品与药物管理局(FDA)在1992年的政策规定：对于含有手性因素的药物倾向于发展单一对映体产品。随后又表示鼓励把已在销售的外消旋药物转化为手性药物称为“手性转换”；对于申请新的外消旋药物，则要求对两个对映体都必须提供详细的生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。据美国C&EN刊物在1999年的报道，全球单一对映体药物依然持续增长，年销售亿达到964亿美元。到2000年，年销售额已突破1300亿美元。按1998年的统计。全球最畅销的500种药中，以单一异构体销售的手性药物占一半以上，占其总销售额的52%。生物制药酶工程和手性药物31手性药物带来的市场效益及增长的需求2001年手性药物销售1472亿美元2000年手性药物销售1320亿美元，比1999年增加13%1999年手性药物销售1170亿美元1997年 手性药物销售910亿美元，比1996年增加21%1993年 手性药物销售356亿美元，比1992年增加22%1990年 手性药物销售180亿美元1997年全世界100个热销药物中，50个是单一对映体(手性药物)

100个热销药物852亿美元

50

个手性药物428

亿美元而在1993年97个热销药中，手性药物占20%生物制药酶工程和手性药物32生物制药酶工程和手性药物手性药物的研究意义－1临床药物1850种天然和半合成药物523种化学合成药物1327种非手性6种手性517种非手性799种手性528种以单个对映体给药509种以外消旋体给药8种以单个对映体给药61种以外消旋体给药467种33生物制药酶工程和手性药物反应停:五十年恩怨(R)-thalidomide(S)-thalidomide手性与人类健康:“反应停”悲剧34生物制药酶工程和手性药物沙利度胺的S-异构体可导致严重的致畸性

1957年～1962年，造成数万名婴儿严重畸形。

进一步研究表明，其致畸作用是由沙利度胺其中的一个异构体（S-异构体）引起的，而R-构型即使大剂量使用，也不会引起致畸作用。图：沙利度胺的另一个对映体可导致严重的致畸性。35生物制药酶工程和手性药物“苦”“甜”36生物制药酶工程和手性药物药物的手性因素－1手性四面体手性碳手性硫手性叔胺37生物制药酶工程和手性药物药物的手性因素－2取代丙二烯类手性轴环芳香类手性平面取代联苯手性轴38生物制药酶工程和手性药物杀虫剂棉酚（Gossypol）及其对映体因分子中两个萘环之间存在阻转异构现象，具有手性轴，有左、右旋对映体。39生物制药酶工程和手性药物药物的手性因素－3螺旋手性（SpiralChirality）：左手螺旋和右手螺旋因旋转方向不同，不能重叠在一起。非平面性环状化合物可以认为是螺旋的一部分，因而产生对映体。40生物制药酶工程和手性药物1,4-Benzodiazepines

P－螺旋M－螺旋

由于C2-C3-N4-C5扭角的方向不同，为正角和负角，分别用P（plus）和M（minus）表示。虽为手性分子，但两种构象相互转变的能垒不高，在室温下可以互相转化，故不表现光学活性。41生物制药酶工程和手性药物2.2手性药物的表示方法－1左旋体和右旋体能使偏振光的偏振面按顺时针方向旋转的对映体称为右旋体（dextrotatory），在药名前用d-或(+)-表示；反之，称为左旋体（levorotatory），在药名前加l-或(-)-表示。外消旋体（racemate）则是由等量的左旋体和右旋体构成，没有旋光性，在其药名前用dl-或()-表示。这种表示方法，直观地反映了对映体之间光学活性的差别，但是不能提供药物分子三维空间排列或绝对构型的信息。42生物制药酶工程和手性药物2.2手性药物的表示方法－2D和L系统以标准参照物的化学相关性来确定药物的立体化学构型。标准参照物有糖类如D-甘油醛，氨基酸如L-丝氨酸。在RR’XHC型光学异构体中，取其主链竖向排列，以氧化态较高或1号碳原子置于上方，照Fisher投影，在所得投影式中X在右边者称为D型，如D-(+)-甘油醛；X在左边者称为L型，如L-(-)-甘油醛；外消旋体表示为DL-甘油醛。43生物制药酶工程和手性药物2.2手性药物的表示方法－2D和L系统由于D/L构型表示法与表示旋光方向的d和l容易混淆，且意义不甚明确，目前多限于糖和氨基酸的立体化学命名。44生物制药酶工程和手性药物2.2手性药物的表示方法－3R和S系统将手性中心的取代基按原子序数依次排列，a>b>c>d，把d作为手性碳原子的顶端，a、b、c为四面体底部的3个角，从底部向顶端方向看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为R型，若为逆时针方向排列者，称为S型。45生物制药酶工程和手性药物沙立度胺（Thalidomide）事件在20世纪60年代出现的沙立度胺事件，成为药学史上的沉痛教训。R-(+)-和S-(-)-沙立度胺都有镇静作用，可用于缓解妊娠妇女的晨吐反应，因而我国仿制时将其称为“反应停”。S-(-)-沙立度胺还有免疫抑制活性。无数妇女服用了消旋药物，减轻了反应，但随后产下了数千例畸胎。46生物制药酶工程和手性药物沙利度胺（Thalidomide）--------天使还是魔鬼？俗名“反应停”，早期作为怀孕妇女的止呕药使用R-(+)-沙利度胺为镇静止呕药

S-(-)-沙利度胺有致畸作用

50年代末，在欧洲出现数千例短肢畸胎新生儿，一度震惊全世界47生物制药酶工程和手性药物多效唑（paclobutrazol）--------杀菌还是助长？(2R,3R)-(+)-杀真菌剂(2S,3S)-(-)-植物增长剂问题：如果只需要杀死真菌，为什么也要喷洒植物生长剂呢？48生物制药酶工程和手性药物掺假食品和饮料的鉴别

--------手性选择指纹图☆分析氨基酸可以鉴别掺假果汁☆比氨基酸更特殊的标记物：苹果酸，乳酸酯、酒石酸和丁二醇☆原料中手性选择指纹图即可以鉴别“原产地”，也使掺假产品难于蒙混过关49生物制药酶工程和手性药物手性分离和分析的重要性★

获取单一对映体化合物

★对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映体选择性的分析方法手性分离的特殊性

在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。50生物制药酶工程和手性药物2获得单一对映体的途径手性源(chiralpool)合成前手性底物不对称合成外消旋体拆分防止“外消旋化”“立体选择性”反应，如手性催化、手性诱导、生物催化结晶法衍生法酶法色谱法51生物制药酶工程和手性药物

●天然手性库：从自然界存在的光活性化合物提取得到，如氨基酸、羟基酸、糖、生物碱和萜类等为原料，采用保持原构型、转化或手性转换等方法合成手性化合物●

不对称合成：采用手性辅助基、手性配体、手性催化剂对前手性底物进行选择性反应●

外消旋体拆分：常规合成方法得到外消旋体产物，如何将它们进一步分离52生物制药酶工程和手性药物3

外消旋体拆分方法

等量对映体的混合物，其旋光性相互抵消，没有旋光能力，称为外消旋体。将外消旋体分为对映体的过程，叫做对映体拆分（resolution）。广义地讲，对不等量对映体混合物进行分离，也属于对映体拆分的范畴。53生物制药酶工程和手性药物接种晶体拆分法

在一个外消旋混合物的热饱和溶液中加入其中的一个纯对映体的晶种，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体上析出；滤去晶体后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，冷却使另一对映体析出。这样交替进行，可方便地获得大量纯对映体结晶。在没有纯对映体晶种的情况下，有时用结构相似的其它手性化合物（有时甚至非手性化合物）作晶种，也能获得成功。（为什么？）晶体形成时的有规律的定向排列，可能自然形成一手性环境。54生物制药酶工程和手性药物D,L氯霉素的母体氨基醇的结晶拆分示意图

D,L-氨基醇水溶液D-氨基醇，80℃冷至20℃D-氨基醇晶体母液80℃浓缩冷至20℃L-氨基醇晶体母液55生物制药酶工程和手性药物3.2生物拆分法

生物酶、微生物、细菌等生物源具有非常专一的反应特性。利用酶可以选择性地使外消旋体中的一个对映体发生反应，如降解，从而达到拆分的目的。因此，这一方法也称为“生物化学拆分法”。

1858年，Pasteur就观察到：外消旋酒石酸在酵母或青霉的存在下进行发酵，天然的（+）-酒石酸铵逐渐被消耗，而经过一段时间之后，从发酵液中分离出纯的（-）-酒石酸铵。这是微生物代谢了天然的（+）-酒石酸，而留下了（-）-酒石酸。56生物制药酶工程和手性药物图5D,L－苯基甘氨酸外消旋体的酶拆分

生物拆分特点：立体专一性强、拆分效率高和生产条件温和。目前，酶法拆分已从水溶液向有机介质发展。D,L-苯基甘氨酸(PG)(CH3C)2-OOD,L-乙酰PGL-氨肽酶L-PGD-乙酰PG水解/H+D-PGD,L-PGH2SO4/加热(外消旋化)57生物制药酶工程和手性药物

用微生物酶拆分外消旋体，比化学拆分法具有明显的优越性：（1）酶催化反应通常具有高度立体专一性；（2）副反应少，产率高，产品分离提纯简单；（3）反应条件较温和，如0~50℃，pH接近中性；（4）酶无毒，易降解，不会造成环境污染，适于规模生产。用酶拆分外消旋体氨基酸特别重要。因为多数合成氨基酸消旋体不易用化学方法拆分，而酶法拆分却非常有效，可用于制备旋光性氨基酸。58生物制药酶工程和手性药物3.4色谱拆分法

如何获得高对映体纯的手性物质在许多领域都是很重要的。色谱法不仅是对映体分析和纯度测定的有力工具，而且液相色谱拆分法还是制备和纯化的重要手段。历史上，曾采用一些天然手性吸附剂，如淀粉、蔗糖、羊毛等成功拆分一些外消旋体。现代制备色谱在拆分外消旋体方面更是发挥更大的作用。如选用拆分能力很强的手性固定相填充剂，用大柱子，一次已能拆分几十克量的外消旋体，并达到99%的旋光纯度。59生物制药酶工程和手性药物4高效手性分离技术

色谱法和电泳法是一类高效分离方法，但常规的色谱/电泳方法仍不能直接分离对映体。（为什么？）因为在非手性环境中，对映体的分离性质（如沸点、蒸气压、溶解度、分配系数、吸附特性以及淌度）完全相同。

如何运用高效色谱和毛细管电泳分离分析对映体化合物？——热力学/分离性质上的差异60生物制药酶工程和手性药物4.2

手性分离原理1）

手性试剂衍生法手性消除采用柱前衍生技术，即用光学纯的手性试剂，将对映体衍生成非对映体复合物，这些非对映体复合物具有不同的理化性质，便能使用常规的色谱技术分离。其优点是可将手性消除和检测衍生反应结合起来。除了满足一般的色谱衍生要求的条件外，还要注意：所用的衍生剂应尽可能达到对映体纯；衍生剂不能选择性地与两种基质对映体反应；生成分离性大的稳定的非对映体。61生物制药酶工程和手性药物

衍生后两种非对映体的检测器响应可能不同，不宜按归一化计算对映体纯度。

手性试剂衍生位置应靠近对映体样品的手性中心，以求获得最大的分离效果。过大的衍生试剂可能会缩小样品理化性质的差异，造成分离困难。作制备用的手性衍生剂要求它的衍生化和去衍生化反应都容易进行，且总收率要高，生成的非对映体具有更大的分离性（有利于提高制备量）。62生物制药酶工程和手性药物

例如将氰醇衍生成Mosher酯后，可用GC或HPLC进行分离测定。苯乙醇氰Mosher酯可用毛细管气相色谱（DurabondDB-5，0.3×30m柱)分离测定：而4-甲氧基苯乙醇氰Mosher酯可用高效液相色谱（Nucleosil100-5柱）分析。外消旋样品手性衍生剂非对映体，挥发性和吸附特性有差异(-)-A·(-)-B//(+)-A·(-)-B63生物制药酶工程和手性药物2)

手性色谱

手性色谱的原理是通过待拆分对映体与手性固定相之间的瞬间可逆相互作用，根据形成瞬间缔合物的难易程度和稳定程度，经过多次质量交换后，达到对映体间的分离。

近年来，高效手性分离技术的发展，导致与有机立体化学相关的手性药物学、分子生物学、材料化学、地球化学、天然有机化学等前沿领域取得许多突破性的发现和发展。衍生法：非对映体的形成是“固定的、永久的”如果设法把手性试剂引入固定相，外消旋体样品流过柱子是否会形成非对映体？64生物制药酶工程和手性药物

与手性衍生法色谱分析不同，对映体组成的测定精度与手性固定相所用的对映体纯度无关（固定相的对映体纯度只影响拆分因子α的大小）。

手性色谱可以通过两种方式进行：手性固定相法手性添加剂法手性拆分原理包括主-客体作用、络合作用、配体交换、相分离、离子交换等。核心是分子手性识别作用，即对映体与固定相（或添加剂）间的相互作用涉及到分子立体选择性。65生物制药酶工程和手性药物三点作用模型

相互作用强，保留长，后出峰相互作用弱，保留短，先出峰基体(S)-选择子(R)-溶质②③①基体(S)-溶质(S)-选择子①②66生物制药酶工程和手性药物

手性固定相具有很强的特征性，一个固定相往往只能拆分一类或几类对映体。手性色谱的另一个特点是将Pirkle型手性固定相的手性变成相反构型，可使对映体洗脱顺序颠倒过来。研制新的手性固定相，解决不同类型手性化合物的分离是手性色谱发展的前沿领域。过去100年：拆分约7000种手性化合物手性色谱：已拆分近万种手性化合物液相色谱中的手性固定相已研制100多种67生物制药酶工程和手性药物手性添加剂法

在液相色谱流动相或毛细管电泳的缓冲溶液中加入手性添加剂（CA），CA与对映体溶质通过静电引力和氢键等非共价键结合方式，形成可逆的不同稳定性的非对映体配合物，在非手性分离器中实现对映异构体的分离。手性添加剂是一种直接拆分法，其优点在于不需要化学衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必须能提供有效的基团和位置以便与溶质对映体形成非对映的配合物，也必须具有合适的结构以改善分离性能和提高其立体选择性。常见的CA可分为手性对离子添加剂、手性配位添加剂和环糊精添加剂。68生物制药酶工程和手性药物TLC分离芳香醇胺对映体

用D-10-樟脑磺酸铵作为手性离子对试剂添加到流动相中，在普通的GF254薄层硅胶板(2.5×10cm)2~4℃展开，拆分拉贝乐尔(Labarol)和倍他乐克(Batarock)两种芳香醇胺药物对映体。LabarolCH2Cl2-CH3OH(67:33)，含D-樟脑磺酸铵6.8mmol/L(b)BatarockCH2Cl2-CH3OH(60:40)，含D-樟脑磺酸铵6.8mmol/L（李高兰等，色谱，1999，17：216）a.Labarolb.Batarock69生物制药酶工程和手性药物HPLC拆分氧氟沙星

国内使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已开发左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)-OFLS-(-)-OFLR-(+)-OFL若改用d-phen,出峰顺序可能发生逆转！70生物制药酶工程和手性药物环糊精结构OHOHHO甲基化71生物制药酶工程和手性药物手性添加剂法拆分苯基琥珀酸15mmol/Lβ-CD+3%CH3CN+0.05%CF3COOH(±)-PSA可采用光活性的番木鳖碱或(-)-脯氨酸拆分

0.30mmol/LTM-β-CD+16%CH3CN+0.05%CF3COOHNova-pakC18色谱柱72生物制药酶工程和手性药物4.3

手性色谱技术★气相色谱★高效液相色谱★毛细管电泳★超临界色谱73生物制药酶工程和手性药物74生物制药酶工程和手性药物75生物制药酶工程和手性药物4.3.1气相色谱GC具有快速、灵敏、简便和定量准确等优点。手性GC特别适合于不对称合成的样品分析。因为分析样品一般无需衍生，反应产物可直接进样分析，用量极微（10-8g），特别适合于跟踪不对称反应的全过程。对于那些对映体纯度>95%的产物，一般要用GC或HPLC代替旋光测定。（为什么？）需要标准旋光值（手册、文献？）旋光测定的误差（多大？）76生物制药酶工程和手性药物

气相色谱手性固定相主要分为：●

氢键型手性固定相：如某些氨基酸衍生物固定相，主要用于分离氨基酸、羧酸、醇、胺、内酯、内酰胺等对映体化合物，氢键作用是对映体分离的主要作用力●

形成包合物的手性固定相：环糊精衍生物手性固定相用于分离稠环烷烃、没有取代的烯烃、卤代烃、醇、醛、酮、胺、氰类、环氧化合物、羧酸、卤代酸、羟基酸、内酯和氨基酸等化合物的对映体。77生物制药酶工程和手性药物●

金属配体交换手性固定相：一些金属离子(Eu、Rh、Ni、Mn、Cu等)与手性试剂(如樟脑酸衍生物，水杨酸与手性胺形成的西佛碱等)所形成的配位化合物。将这类固定相与某些色谱固定液（如鲨鱼烷）混合，涂到毛细管柱上分离烯烃、环酮、醇、胺、环氧化合物、氨基醇、氨基酸、羟基酸和卤代酸等化合物的对映体●

手性聚硅氧烷固定相及交联手性固定相：以聚硅氧烷为基质，键合一定浓度的手性固定相的新型色谱固定相。这一类固定相改善了手性固定相的耐温性，扩大其使用温度范围，增进涂渍性能。交联手性固定相专指将手性固定相与毛细管壁交联而成色谱柱。交联毛细管柱一般具有耐溶剂冲洗、耐高温、寿命长、柱效高等特点，并在超临界流体色谱条件下使用。78生物制药酶工程和手性药物4.3.2高效液相色谱

手性固定相分类：

●选择基键合相（Pirkle手性固定相）●纤维素和多糖衍生物●环糊精●蛋白质键合相●合成聚合物与分子烙印手性固定相拆分机理：氢键、π-π键、偶极-偶极、包合络合物、配位交换、疏水和极性相互作用的偶合。79生物制药酶工程和手性药物选择基键合相（Pirkle手性固定相）

美国Illinois大学的WHPirkle研究组研制，因此又称Pirkle型或多种作用（multiple-interaction）手性固定相，其商品以Brush-Type（刷性）著称。在手性液相色谱领域，Pirkle型CSP是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深刻的一类重要CSP。它们具有确定化学结构，其共同结构特征是在手性中心附近至少含有下列基团之一：（1）π-酸或π-碱芳基，具有给体-受体相互作用能力（电子转移络合）。（2）

极性氢键给体/受体。（3）

形成偶极相互作用的极性基团。（4）大体积非极性基团，提供立体位阻、范德华作用或构型控制作用。80生物制药酶工程和手性药物

Pirkle型手性柱分为酰胺型和脲型CSP两种结构。它一般用于正相色谱体系，以含一定量异丙醇（0.2~20%）的正己烷为流动相，有时也采用四氢呋喃和其它氢键受体溶剂。它也用于反相体系分离强极性溶质。

Pirkle型CSP的优点是柱效和柱容量高，不仅用于对映体分析，也可用于对映体制备分离。基于手性识别机理，可预测对映体洗脱顺序，确定其构型。其不足是被分离的溶质大部分需衍生以引入芳基等手性识别所需基团；多使用非极性溶剂作流动相，溶解度可能限制对某些溶质的应用。81生物制药酶工程和手性药物S-3R-3S-2R-2t/min

246t/min2468R-1S-1abChiral(S)-LEU&(S)-NEAcolumn,flowrate1.0mL/min,wavelengthdetection275nm.Mobilephase:a)n-hexane/1,2-dichloroethane/ethanol(97.5:2.45:0.05，v/v/v);b)n-hexane/1,2-dichloroethane/ethanol(86:12:2，v/v/v)82生物制药酶工程和手性药物纤维素和多糖衍生物

纤维素是D（+）-葡萄糖单元由1，4-糖苷键形成的高度有序、呈螺旋型孔穴结构的光学活性高分子。但天然的纤维素手性拆分能力不高，色谱性能也不好，难于直接由于对映体拆分。引入新基团

对纤维素和多糖等天然手性高分子进行衍生改性，可制备性能优良的手性固定相。

三种形式：凝胶颗粒；键合固定相和硅胶涂渍。在目前在手性液相色谱中，纤维素及其衍生物大多涂渍在硅胶上使用。日本Diacel公司大量提供这类商品手性色谱柱。83生物制药酶工程和手性药物

研究表明，纤维素类CSP手性识别取决于聚合物螺旋型孔穴的“立体配合”（stericfit）包结作用，CSP的通道对芳环有较高的亲和力，进入孔穴的正是溶质分子的芳环部分。氢键、偶极作用对手性识别亦有一定影响。大部分可拆分的对映体至少含有一个芳环或可形成氢键的羰基。纤维素CSP用水或非水溶性溶剂作流动相，除少数例外，适用的有机溶剂限于正己烷、异丙醇、甲醇、乙醇。流动相影响对映体分离的选择性，非极性溶剂通常比甲醇/水混合液显示出更高的分离选择性。这类CSP具有应用范围广，样品容量高的优点。缺点是柱效低，有些溶质显示不可逆吸附，且多为涂渍柱，较易流失，对所用溶剂有一定限制。已报道分离氨基酸、醇、酮及各种手性药物的80~85%是使用OD、OJ和AD柱.84生物制药酶工程和手性药物高效液相色谱拆分外消旋1-苯基乙醇类化合物

三苯甲酸酯纤维素手性色谱柱（CHIRACELOB，I.D.4.6×250mm）拆分1-苯基乙醇、1-苯基丙醇、2-氯-1-苯基乙醇和2-溴-1-苯基乙醇外消旋化合物，可用于监测不对称催化氢化反应过程和测定产物对映体过剩值。（厦门大学学报，1998，37（2）：309）(S)-(-)苯乙醇

(R)-(+)苯乙醇

R：H，Cl，Br，CH385生物制药酶工程和手性药物合成聚合物与分子烙印手性固定相

合成手性聚合物CSP的制备主要通过三种途径：（1）在手性条件下不对称聚合；（2）采用手性单体；（3）手性分子烙印技术。分子烙印(imprinting)手性固定相是在聚合过程中加入一个适当的模板(template)分子，然后从聚合物中除去模板分子，流下一个“形状选择性”(shapeselectivity)孔穴，形成适合于孔穴立体选择的聚合物。86生物制药酶工程和手性药物4.3.3毛细管电泳

毛细管电泳(CE)是20世纪90年代在手性分离方面得到广泛应用和高度重视的一项高效能分离技术。毛细管电泳分离对映体的优点：★高分离效率有利于难分离对映体拆分★手性选择剂的消耗量小，运行成本低87生物制药酶工程和手性药物

以毛细管电泳分离对映体为例说明如何提高物质的分离度，分离方法的优化途径。思路：毛细管电泳和常规电泳比较；对映体分离的特点。毛细管电泳采用上万伏外电压进行电泳——增大外加场；存在问题：焦耳热增大，使分离过程物质带的离散作用增大，即熵增，区带增宽。毛细管电流较小，而散热面积很大，降低或抑制熵增；使用手性添加剂或固定相，导致对映体间的淌度或分配系数差异增大。88生物制药酶工程和手性药物1）环糊精及其衍生物

环糊精及其衍生物常用作毛细管区带电泳手性添加剂。2）2)冠醚Ｋuhn等将具有4个手性中心的18-冠6-四羧酸(18C6H4)作手性添加剂,对α氨基酸对映体，重酒石酸去甲肾上腺素，降麻黄碱，phenylglycinol等进行了分离。3）抗生素

Armstrong等将大环抗生素利福霉素B用于毛细管电泳手性添加剂,对18种氨基酸类手性药物的对映体进行分离。最近他们发现糖肽类的抗生素ristocetinA,teicoplanin,vancomycin等具有非常广泛的对映体分离选择性,可对上百种对映体进行成功的分离。4）蛋白质蛋白质也被成功地用于毛细管电泳手性分离。此外还有多糖，手性表面活性剂，旋光金属配合物等也用作手性选择剂。89生物制药酶工程和手性药物毛细管区带电泳手性添加剂法分离

异丙肾上腺素类药物

环糊精及其衍生物常用作毛细管区带电泳手性添加剂。异丙肾上腺素为碱性化合物，在pH<7.00时因质子化而带正电，其电泳方向与电渗流同向。

β-CD是电中性物质，随电渗流一起迁移。所以pH值越小，异丙肾上腺素与β-CD的迁移速度差越大，越有利于对映体的分离。而CM-β-CD（羧甲基-）在背景电解质中发生电离而变为带有负电荷的阴离子，电泳方向与手性分子相反。（王洪等，色谱，1998，16（1）：22）90生物制药酶工程和手性药物Fig.16Theinfluenceofacetonitrileontheseparationofenantiomers3mmODS,50mmI.D.capillary,25.9cmspacked,52cmstotallength,Electrolyte:Acetonitrile/PhosphatebufferpH=6.5,Ratioa)15:85,b)20:80,c)25:75,with10mMHP-b-CD(1mMNa2HPO4,adjustedtopH=6.5withconcentratedH3PO4),AppliedVoltage15kV,Detectionat220nm.区带电泳Chlorthalidone氯噻酮isadrugexhibitingdiureticandhypertensiveactivity,butsinceitisneutral,itsenantiomerscannotbeseparatedbyCZEusinganeutralchiralselector.HPLC:CyclobondI2000RSPcolumn,CH3CN-70mMtriethylamine(5:95v/v)adjustedtopH4.1withaceticacid.92生物制药酶工程和手性药物Fig.Separationsatdifferentacetonitrileconcentrations5mmHPbCDbondedsilicaparticles,50mmI.D.capillary,27cmspacked,58cmstotallength,AppliedVoltage15kV,Detectionat220nm.电色谱分离Electrolyte:Acetonitrile/PhosphatebufferpH=6.5,Ratio15:85,b)20:80,25:75,d)30:70

(5mMNa2HPO4adjustedtopH=6.5withconcentratedH3PO4）93生物制药酶工程和手性药物4.4其他高效手性分离技术●

手性超临界色谱（SFC）：和HPLC相比，超临界色谱可获得较高的分离度和较高的检测灵敏度；和GC相比，它不仅可分离分子量更大的组分，而且可在较低的温度下分离，从而有更好的对映体选择性。手性超临界色谱还可用于对映体的制备分离。●

模拟流动相色谱（SMB）：模拟流动床色谱最早用于正己烷和环己烷分离，后来用于间二甲苯和对二甲苯的大规模制备。92年Negawa等人把它用于手性物质的拆分。模拟流动床色谱手性拆分系统在运行过程中，旋转阀间歇性地开关，控制在不同时间外消旋体的进样、新溶剂的注入和两个旋光异构体的提取位置。●手性膜分离：早期有液块液膜手性分离。最近，有报道采用U-1环糊精聚合物膜拆分氨基酸对映体。（龙远德，黄天宝，高等学校化学学报，1999，20：884-886）

94生物制药酶工程和手性药物5手性化合物的分离分析应用

手性化合物的光学纯度测定在实际样品中对映异构体的含量分析95生物制药酶工程和手性药物5.1手性化合物的光学纯度测定

在不对称合成、外消旋体拆分和手性药物质量控制中，需要测定对映异构体的纯度。如在不对称合成中，一个最基本的问题是如何获得高对映体纯的手性物质（手性辅助基、手性配体、手性催化剂）。在一般情况下高立体选择性的不对称反应需要高对映体纯的手性原料，只有少数不对称反应具