发酵-菌种的来源

发酵——菌种的来源第1页/共45页第一节微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厌氧的条件下生长

有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长

有些微生物能进行复杂的代谢

有些微生物能利用较复杂的化合物

有些微生物能在极端的环境下生长第2页/共45页二：工业化菌种的要求

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求第3页/共45页放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节已工业化产品生产菌的介绍第4页/共45页放线菌产生的主要抗生素链霉菌稀有放线菌氨基糖苷类氯霉素链霉素环丝氨酸林可霉素新生霉素小单胞菌氨基糖苷类大环内酯类肽类游动放线菌缩酚肽类肽类多烯类诺卡氏菌氨基糖苷类氯霉素链孢囊菌氨基糖苷类优胜霉素普拉克托霉素第5页/共45页二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：第6页/共45页HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶第7页/共45页氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌第8页/共45页三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌第9页/共45页三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌沙门氏菌

生长迅速、蛋白产量高;

表达蛋白的纯化、分离及分析快速；

外源基因的导入相对容易；

已建立了整套表达理论及技术.第10页/共45页(二)真核细胞表达系统

酵母(既是微生物又是真核细胞)

生长迅速，营养要求不高，易培养；

安全性好；

比哺乳动物细胞操作简单；

具有一定的修饰蛋白的能力。第11页/共45页

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统

具有准确的转录后修饰功能；

具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；

具有重组基因的高效扩增和表达能力；

具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；

CHO很少分泌自身的内源蛋白。第12页/共45页微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Elililly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第13页/共45页第三节自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：第14页/共45页二、采样时要注意的问题

气候、水分、空气

来源要广

结合产品的特点

标签：地点、时间、气候等第15页/共45页富集的三种方案：

定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，

不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法第16页/共45页定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法第17页/共45页定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。第18页/共45页四、菌落的选出

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。第19页/共45页实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓第20页/共45页例：醛肟水解酶的筛选

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落第21页/共45页五、目的微生物富集方法的研究进展

分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等

目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。

2002,陈文新（科学院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第22页/共45页第四节菌株选育、分子改造目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化第23页/共45页方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等自然选育；生产选育；抗噬菌体菌株选育；诱变育种；代谢控制育种；基因重组育种第24页/共45页自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育第25页/共45页自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？第26页/共45页自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验第27页/共45页二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{第28页/共45页超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机第29页/共45页（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH第30页/共45页（三）、诱变育种的一般步骤(p83)（四）、筛选的方法

随机筛选

形态

理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。第31页/共45页HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型第32页/共45页黄色短杆菌F9-50的诱变谱系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第33页/共45页三、基因的直接进化(directedevolution)

突变基因突变库的建立筛选基因突变库的筛选基因复制与遗传步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。第34页/共45页定点突变第35页/共45页错位PCR第36页/共45页DNAShuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。第37页/共45页基因重组第38页/共45页质粒载体第39页/共45页DNA扩增PCR反应第40页/共45页重组DNA的鉴定遗传学方法第41页/共45页类型示例特性活性增加倍数潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药β-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65℃耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNAShuffling技术的研究成果第42页/共45页主要应用：酶学