发酵工程制药二

发酵工程制药二第1页/共44页以天然产物为基础发展药物的方法获得新型结构和生物活性的抗生素变得越来越难一.自然分离合成步骤繁多、合成产率低下二.化学合成以微生物作为“细胞工厂”，通过对代谢途径的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。第2页/共44页基因工程改造传统制药工业

体现在四个方面1、抗生素生产：分离抗生素合成酶基因，提高产量、得到杂合抗生素；2、氨基酸生产：基因克隆的工程菌、细胞融合育种；3、维生素生产：构建制造维生素C的基因工程菌；4、疫苗生产：把抗原克隆到E.coli中大量生产疫苗。第3页/共44页直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。菌种选育突变、体内重组、体外重组（基因工程）一、基因工程在抗生素生产中的应用往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产第4页/共44页微生物基因工程育种

这是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。获得特定的目标基因载体(质粒或病毒)目标基因片段质粒DNA片段内切酶切割细胞外重组重组DNA重组DNA进入受体细胞并扩增、表达具有目标基因表达功能的重组体利用遗传标记筛选转化(质粒)、转导或转染(病毒)第5页/共44页（一）抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法1、抗生素生物合成基因群成员的结构特点

在已知的微生物所产生的抗生素中，约2／3由放线菌产生，而其中的80％来源于链霉菌；链霉菌属中的链霉菌，有约500个种。第6页/共44页2002年5月，BentleyS.D.等在英国Nature报道了链霉菌的模式种天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)菌株的基因组全序列研究结果：基因组全序8,667,507bp，GC含量72.12%，7825个基因，55个假基因，基因平均长度991bp，编码密度88.9%。⑴链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成GC含量高达70％以上；三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高。第7页/共44页⑵抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个;阿克拉霉素每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后排列成基因簇(genecluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。研究还发现，产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的抗菌素产量水平呈正相关。第8页/共44页阿克拉霉素Aclacinomycin目前用于治疗急性白血病(Leukemia)与淋巴瘤(Lymphomas)有良好疗效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomycesgalilaeus合成的聚酮类化合物，其合成酶的生物合成涉及13个基因，紧密成簇排列。返回第9页/共44页⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上

如天蓝色链霉菌3(2)菌株中的次甲霉素A（MethylenomycinA）的生物合成基因位于SCP1质粒上。第10页/共44页抗生素生物合成基因群成员的结构特点⑴链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成：GC含量高达70％以上、三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高；⑵抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个；⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上。第11页/共44页7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这7个方法是：在标准宿主系统中克隆检测单基因产物阻断变株法突变克隆法直接克隆法克隆抗生素抗性基因法寡核苷酸探针法同源基因杂交法2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法第12页/共44页⑴在标准宿主系统中克隆检测单基因产物

“鸟枪法”克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。对氨基苯甲酸合成酶(PABA)基因(pab)是灰色链霉菌的杀念珠菌素生物合成酶基因簇的一个成员；以pab＋

(野生型)灰色链霉菌菌株为供体，提取总DNA、BamHⅠ切割、与质粒pIJ41重组、转化pab－

(PABA营养缺陷型)菌株，选择pab＋

(PABA营养原养型)菌株；过量表达PABA的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、鸟枪法转化变青链霉菌66，在转化子中筛选PABA原养型或磺胺抗性菌株；二者筛选出来的阳性转化子都携带一个45kb的BamHⅠ片段，意味着pab基因与磺胺抗性基因可能是同一个基因。第13页/共44页鸟枪法克隆目的基因的基本战略

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。

第14页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑵阻断变株法

检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的DNA片段的性质。

放线紫红素(actinorhodin)是由天蓝链霉菌合成的多酮肽抗菌素,大约通过16个步骤合成；对76个阻断突变体(act

-)进行互补测验研究，Rudd和Hopwood将它们分成7个组，每组代表在不同的生物合成步骤发生损伤。ActⅠ和actⅢ不能与其它突变株互补，说明这两个突变发生在放线紫红素生物合成的最早期的步骤中；第15页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑵阻断变株法

检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的DNA片段的性质。

用pIJ922质粒从act+菌株中克隆了一个BamHⅠ25bp片段，可以与除act外的其它阻断株互补；用基因克隆的方法，将act+菌株中相当大的DNA片段(15～30kb)克隆到载体pJJ922上，组建成重组质粒pJJ2303，它能互补所有7组act

-突变株，并能使不产生任何一类多酮肽抗菌素的小小链霉菌合成放线紫红素。这个片段显然是放线紫红素生物合成全部基因组成的基因簇。第16页/共44页放线紫红素阻断突变株之间的互补测验前体中间产物2中间产物14中间产物15中间产物1放线紫红素act－act－act－act－

act－act－×无中间产物2act－☆act－

※act－act－☆××act－act－

※无15无紫红素第17页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑶突变克隆法

如果生物合成基因簇DNA的酶切片段通过同源重组插入诱发基因簇相关合成步骤的阻断突变，这个酶切片段一定含有这个合成步骤的相关基因。小小链霉菌(S.parvullus)

菌株ATCC12434的质粒SCP1(含次甲霉素A生物合成基因簇)的DNA的PstⅠ片段插入到

C31KC400(attP－)中，形成质粒SCP1的gDNA文库；转染变青链霉菌66(S.lividans)，把噬菌斑影印到变青链霉菌(SCP1+)的菌膜上，用C31KC400的紫霉素抗性选择溶源菌；从溶源菌中选择次甲霉素生物合成阻断突变株，分析表明这些阻断突变株都含有来自C31KC400的PstⅠDNA片段;突变分析结果：SCP1上至少有17kbDNA参与次甲霉素生物合成，其中两个转录单位分别至少有两个次甲霉素生物合成基因簇成员；第18页/共44页【突变克隆法原理图解】123456123456片段克隆到噬菌体或整合性质粒中，以同源性重组方式插入相应的基因中。2－2－5－5－无阻断?阻断第19页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑷直接克隆法

抗生素生物合成基因成簇存在，总长度～30kb，成套克隆基因簇是可能的。头霉素C(CephamycinC)是牲畜链霉菌表达的-内酰胺类抗生素；Panlabs公司将牲畜链霉菌总DNA的20～40kb的BglⅡ部分消化片段克隆到质粒pIJ943中，转化变青链霉菌1326；以不产黑色素、有硫链丝菌素(Thiostrepton)抗性(tsr为pIJ943的选择标记)确定转化子；第20页/共44页⑷直接克隆法

抗生素生物合成基因成簇存在，总长度～30kb，成套克隆基因簇是可能的。在固体培养基上用Comamonasterrigena(土生丛毛单胞菌)直接筛选抗菌活性(头霉素C表达)；从30,000多个转化子中得到一个有抗菌活性的转化子PF15-1，多项分析表明：抗菌活性来自头霉素C；把PF15-1中的29.3kb片段插入质粒pIF900，转化变青链霉菌1326，转化子同样产生了头霉素C：29.3kb含有头霉素C生物合成基因簇。第21页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑸抗生素抗性基因克隆法

抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于克隆基因簇。抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。在吸水链霉菌(S．Hydroscopicus)中，与双丙氨磷(bialaphos)合成基因紧密连锁的抗性基因bar所编码的产物与bialaphos生物合成途径第10步所需的乙酸基转移酶相同，bar可能是bialaphos生物合成途径的一部分。在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主要是为了应对环境的抗生素压力，可以存在于质粒上。第22页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑸抗生素抗性基因克隆法

抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于克隆基因簇。红霉素是红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)产生的抗生素；用MboⅠ处理红色糖多孢菌NRRLC2338菌株DNA，与穿梭往复粘粒pKC462a重组，转导E.coliSF8；以含有eryr的质粒pIJ43为探针，与转导子原位杂交；分析表明：阳性转导子的pKC462a中携带35kb的插入片段；用这个片段转化变青链霉菌，转化子产红霉素。第23页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑹寡核苷酸探针法

链霉菌编码抗生素生物合成基因ORF顺序的密码子的第3位碱基多达90％为G或C，是探针设计的根据。

泰乐星(tylosin)是由弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)产生的一种大环内酯类抗生素，临床上主要作为治疗鸡慢性呼吸道感染和鸡霍乱等常见病，对由病毒引起的猪气喘和猪肺炎有特效。第24页/共44页EliLilly公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一个步骤的大环菌素-O-甲基转移酶(Macrocin-0-methyltransferase)氨基端35个氨基酸顺序，按照密码子偏爱原则合成了44bp的寡核苷酸探针；用Charon4构建弗氏链霉菌的gDNA文库，与探针逐一杂交，10个重叠克隆共涉及27kbDNA；与用粘粒pKC462a构建的弗氏链霉菌的gDNA文库杂交，有4个重叠克隆共包含58kb片段，其中包括前面的27kb片段；进一步分析表明，58kbDNA中编码Tylosin生物合成全部基因。2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑹寡核苷酸探针法链霉菌编码抗生素生物合成基因ORF顺序的密码子的第3位碱基多达90％为G或C，是探针设计的根据。第25页/共44页2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑺同源基因杂交法

以已克隆的抗生素生物合成基因片段顺序为探针，探察同源性基因。β-内酰胺类：分子结构中含有β-内酰胺，包括青霉素类和头孢菌素类。氨基糖甙类：由氨基己糖的衍生物组成，包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、小诺霉素等。四环类：都具有四个缩合苯环，包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。氯霉素类：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。大环内脂类：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成一个巨大的芳香内酯环化合物，有红霉素、麦迪霉素等。

第26页/共44页化学结构类似的抗生素，其生物合成途径和每个合成环节的酶也相似，编码酶的基因之间存在同源性；用放线紫红素的actⅡ和actⅣ做探针，与24种产氨基糖苷类抗生素的链霉菌DNA杂交，可产生特异性杂交带；用actⅡ为探针，成功地克隆了榴菌素(granaticin)和杀螨菌素(milbemycin)的生物合成基因簇；利用红霉素的eryA1基因克隆了苦霉素(picromycin)生物合成相关基因；利用碳霉素(carbomycin)的carE基因克隆了麦迪霉素的4-羟基苯酰基转移酶基因；2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法⑺同源基因杂交法

以已克隆的抗生素生物合成基因片段顺序为探针，探察同源性基因。第27页/共44页抗生素生物合成是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成是一个复杂的，多因素的调节过程，抗生素的生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节和控制。放线紫红素红霉素青霉素链霉素（二）几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构第28页/共44页（三）提高抗生素的产量1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株所有参与生物合成过程的基因都是克隆的候选者；主要的候选基因是限速基因和生物合成调节基因；这些基因向原菌株的克隆是随机的；克隆后的筛选是这项措施的关键；第29页/共44页（三）提高抗生素的产量2、增加参与生物合成中的限速阶段基因的拷贝数反馈抑制(feedbackinhibition)是生物合成限速反应的实质，一般是终产物对合成反应某个环节发挥作用的酶活力的抑制，这个环节就是“限速瓶颈”，被抑制的酶就是“限速酶”。增加酶基因的拷贝数以提高限速酶的的浓度是增产的基本措施；天蓝链霉菌十一烷基灵红菌素的生物合成最后一步的0-甲基转移酶、泰乐星生物合成的最后一步的0-甲基转移酶，增加这个酶基因的拷贝数可以提高终产物的产量。异青霉素合成酶(IsopenicillinNSynthetase,IPNS)的基因与酰基转移酶基因紧密连锁，可能是青霉菌(Penicilliumsp.)青霉素生物合成的限速酶；青霉素N做为头孢菌素C的中间产物，它的积累使头孢菌素C产量下降。说明扩环酶基因cefEF属于限速酶；第30页/共44页（三）提高抗生素的产量3、发挥调节基因的作用抗生素生物合成基因簇中存在调节基因，以精细调节整个基因簇成员的表达强度；增加正调控基因拷贝数可以增加抗生素的产量；降低负调控基因的活性也可以提高抗生素的产量；天蓝色链霉菌(S.colicolor)的放线紫红素(actinorhodin)生物合成基因簇成员actⅡ的四个ORFs都是调控基因，对actⅠ、actⅢ和其它基因起正调控作用；增加actⅡ的剂量可以使放线紫红素产量提高20-40%。actⅡ(编码聚酮合成酶ketosynthase,KS和链长决定子chainlengthdetermining,CLF)；actⅢ(编码酮基还原酶ketoreductase,KR)第31页/共44页（三）提高抗生素的产量4、增加抗性基因的拷贝数有些抗性基因本身就是抗生素生物合成基因簇成员，甚至做为一个合成环节参与抗生素的生物合成；抗性基因先于生物合成基因表达，即在建立抗性后，抗生素生物合成基因才能表达、合成抗生素；抗性基因表达的强度和体现的抗性水平与抗生素合成水平呈现平行关系：如果提高抗性水平就可以提高抗生素合成水平；氨基糖苷类抗生素抗性基因aacA(编码6’-N-氨基糖苷乙酰转移酶)，增加这个的拷贝数可以提高新霉素和卡那霉素的生物合成量；第32页/共44页1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株2、增加参与生物合成种限速阶段基因的拷贝数3、发挥调节基因的作用4、增加抗性基因的拷贝数提高抗生素的产量的主要措施第33页/共44页（四）改善抗生素组分许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和精制带来很大不便。应用基因工程方法可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。用阿维菌素B2a生产伊维菌素，产同时产生8个组分，4个主要组分A1a、A2a、B1a、B2a和4个次要组分A1b、A2b、B1b、B2b。A与B组分的区别在于C-5的羟化基因上是否连有甲基，这是由5-O-甲基转移酶基因（aveD）决定。选育只产生阿维菌素B2a组分的菌种是非常有意义的。为此，至少要引入3个突变。第34页/共44页（五）改进抗生素生产工艺传统方法往往只能改变最适操作条件、降低细胞生物速率或密度来提高供氧水平。利用重组DNA技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，在细胞中表达血红蛋白，可望从提高细胞自身代高功能入手解决溶氧供求矛盾，提高氧的利用率，具有良好的应用前景。将丝状细胞——透明颤菌的血红蛋白基因克隆到放线菌中，可促进有氧代谢、菌体生长和抗生素的合成。这一血红蛋白含有两个亚基和146个氨基酸残基，相对分子质量为1.56×105。第35页/共44页生物合成途径中某个酶基因的突变在生物合成途径中引入一个酶基因利用底物特异性不强的酶催化形成新产物（六）产生杂合抗生素第36页/共44页有针对性地对某些基因进行操作，如替换、阻断、重组等均有可能改变其生物合成途径而产生新的代谢旁路，形成新的化合物。组合生物合成的基本过程是将不同来源的基因组合，在异源宿主细胞中进行基因表达，将宿主细胞产生的化合物分离提纯，对化合物的结构进行解析，推测生物合成规律。组合生物合成的特点（七）组合生物合成第37页/共44页二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用

㈠在氨基酸生产中的应用以E.coli

为主的基因工程技术的应用：充分利用氨基酸合成操纵子的调控成分，如弱化子(attenuator)缺失、阻遏物基因突变、解除反馈抑制(限速反应)等；酶法生产氨基酸