生物化学辅导讲义部分

RRR构件分子构件分子一、蛋白质的功能多样催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细胞外1/4。细胞里的片层结构，功能脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中功能某些蛋白质的作用是氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗信息传递功能生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传递有1二、蛋白质的水解【常见考酸水解6MHCl4MH2SO4，105℃20可完全水解。酸水解不引起氨基酸一、20种氨基酸简符符GAVLIMP链既与 碳原子结合又与氨基N-原子结合缺少H-bonddonor，无法形成α螺FYWNHNHSTAQcysteinCKpHR末端是胍基中性pH时侧链H质子化后带正电荷。咪唑的pKa值接近于6，在pHDpHE两种氨基酸的作用是接受质子，对蛋白质功能起重要作按照R的化学结构分：GlyR（Gly为H（6Phe2.5、Trp3.4Tyr2.3：SerSer的-OH基是极性基团，易与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义，在大多Ser残基Thr中的-OH是仲醇，具有亲水性，但形成氢键的能力较弱，在酶的活性中心很少：CysCys（半胱氨酸）R中含巯基-SHCys的-SHCysSH+CysSHCys-S-SCysMet（-S-CH3）（4）Racidicgroup（2：Asp、GluAsppKa（β-COOH）3.86；GlupKa（γ-COOH）4.25它们在生理条件下带有负电荷：Asn：BasicLysR，pKa10.53Lys侧链带有一个正电4C，柔性较大，使侧链氨基的反应活性增大ArgpKa12.48，：Phe都具有共轭ππcharge-transfercomplex)，在分子相互识别过程中具有重要作用。2种氨基酸在紫外区有特征吸收峰。：Trp280nm，TrpTyr，PheHispKapKa6.007.35，20pKapHpHProα-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊按照R的极性可以分为4Nonpolaraminoacids（8Polar,unchargedaminoacids（7：Glu带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）Basicacids（3）Arg、Lys、非极性氨基酸一般位于蛋白质的疏水，带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于蛋白质表 A．LeuB．AlaC．GlyD．SerpH7链的氨基酸残基：Asp、Lys、HisCys，因其常常参与链内和链间的二硫键的形成，使其极性（C）A、半胱氨 下列氨基酸哪个含有吲哚环（AMetBPheCTrpDATrpBTyrCHisD7（AAArgB C D重点解析在280nm吸光值升高的有Trp，Tyr，Phe配合知识 A重点解析在280nm吸光值升高的有Trp，Tyr，Phe配合知识 Tyr苯环上的-OH0.01%,PI值按RTyrPK1=2.20，PK2=9.11，PKR=10.07，TyrPI应为（D）A6.135B5.035C9.59D解答：在280nm的吸收与TrpTyr有关，因为这两种氨基酸在280nm最大吸收，而Phe的最大吸收再260nm。由于B含有2Trp残基和1Tyr基，而A只含有TyrB280nm二、氨基酸的性（一）紫外吸收三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，F:257nm,ε=200;Y:275nm,ε=1400;（二）③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、使水的介电常数降低），水α-羧基pK12.0，pH>3.5，α-羧基以COO-形式存在α-氨基pK29.4，pH<8.0，α-氨基以NH3+形式存在K1K2’来pH(pI)。等电点的值是它pK’值的算术平均值。氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离pK1’、pK2’、pK3’表示。氨基酸可作为pK’处的缓冲能力最强，pI酸碱滴定曲线（Titration）：Gly解离和滴定曲Gly的等电点（Isoelectricpoint）pI135pHpICOOHCOOpHpIpHpINH2NH3+，氨基酸带正电荷，向负极移动（1）pHpK，pI氨基酸pI不同pHpHpIpHpIpHpI叫滴定法，可用于测定氨基酸。AA，后者在硝AAEdmanN-末端氨基酸，360nm氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二基氨基酸（DNP氨N-末端测定。二硫键(disulfide（AECys酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸和亚硝酸反应，生成白色沉淀，加热后变红，称为 A丙氨酸B亮氨酸C异亮氨酸D2如何用茚三酮反应定量测定氨基酸含3.一、蛋白质通（一）氨基酸（aminoacid）蛋白质：20L-型α10。①简单蛋白完全由氨基酸组成不含非蛋白成分如清蛋白等根据溶解性的不同，②结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋含量（干重）：微生物50-80%；45%；一般细胞种类：大肠杆菌3000；35000左右；生物界1010-少于50aminoacids－peptide50amino氨基酸平均分子量138，平均分子量128，扣除1个水分10.34%，血红蛋白的最小相对分子量是多少？实验表明，血红蛋白的64500，实际上一个血红蛋白含几个铁原子？ 204 70000，（1） （1） （2） 30.335%，其最低分子量可依下式计算：计算结果为计算结果为子量为5.一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质的最低相对分 二、肽肽键：氨基酸间脱水后形成的酰氨键。两个氨基酸形成的肽——二肽。少于10的肽——寡肽。多于10个氨基酸的肽——多肽。肽键的结构特点：（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的作用，形成杂化肽键亚氨基在pH0-14在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离。肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ2和Ｃ端α－COOHproteinsidegroups。肽的α-羧基，α-氨基和侧链R双缩脲反应是peptideproteinCuSO4在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基。protein活性中心的巯2GSH——GS—H2O2+2GSH——2H2O+GS—由短杆菌产生的10MetTyr—Gly—Gly—Phe—Met脑啡肽：protein三、Sequenceprimarystructure（一级结构序列，共价结构一级结构意义：protein（序列）预测：空间结构（高级结构）——功能蛋白质步（一）protein的一般步测定protein拆分protein分析多肽链的NC89（二）protein的基本策对于一个纯protein，理想的方法是从NC60N直接法（测protein）N法裂解A1A2A3法裂解B1B2B3protein⑵DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）测N用于估算氨基酸残基数n⑴拆离四级结构：SDSmol/L过甲酸氧化—S—SHCOOOHSO3Hβ巯基乙醇还原分子量：MM1、M2M1M2分子量关系：M=2M1+2M2①NDNFB：Sanger，DNP-多肽，酸水解，黄色DNPPITC：EdmanPTH②CA-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH氨基酸的酰肼，用苯沉淀，C端在上清中Gln、Asn、Cys、Arg羧肽酶法（Pro羧肽酶A：除Pro、Arg、LysC①溴化—Met—X—产率②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X70-④羟胺NH2OH—Asn—Gly—约150 ①胰蛋白酶Lys—X(XPro)，Arg—X②胰凝乳蛋白酶Tyr—X(XPro)③GluGlu—④ArgArg—⑤LysX—⑥ProPro—分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度。常用ＤＮＳ－Cl要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一Edman（1）耦联PITCH２N—A-B-C-DpH8-（2）裂解PTC—A-B-C-DTFA——ATZ—A+H2N—B-C-（3）转化ATZ—APTH—DNS-Edman用DNSNEdman（n-1）肽段有色Edman荧光基团或有色试剂标记的PITC仪器原理：Edman60－701967液相仪，自旋反应器，适于大肽1971固相仪，表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ1981气相仪，用Polybrene反应器（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol20-40肽97%气相：5pmol60肽16肽，N端H，Ｃ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWTＢ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭-SHprotein酶解肽链，产生含单个AsxGlxAspAsn举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu糖类通过Asn、SerproteinN-糖苷-0-糖苷Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)（（了一个残基）13EdmanVal-Asp-Leu-Gly- 、有一多肽，其分子式是10N103 将滤 5分离蛋白质混合物的方法主要是根据蛋白质在溶液中的哪些性质？如果蛋白质溶液中酸水解得Ala，Arg，ThrLeu，Met，Phe，2ValSangerDNP-AlaDNP-Val。二；溴化裂解，得出（4二；溴化裂解，得出（4，第（1）（1（2 （a）（b）（c）脲、β（d）胰凝乳蛋（e）CNBr;（f）胰蛋白酶。第四节蛋白质的一级结构与生物功Insulin（胰岛素）：51A21，B30A链内有12硫键Cys6CysA.B22A.Cys7B.Cys7A.Cys20B.Cys分子量：5700RNAase：1244分子量：12600牛胰RNAase变性一复性实验二、同源蛋白质种属差异与生物进化（一级结构的种属差异同源蛋白质（homologousprotein）：不同的生物体内具有同能的蛋白质，由同一祖先进化而来。如：hemoglobin具有输送氧气的功能，cytochrome在所有的生物中都是Homologousproteinresidue），通过比较homologousprotein（aminoacidsequence）序列同源性（sequencehomology）：亲源关系越远，homologousproteinaminoacidsequence差异就越大。①.细胞色素C（cytochromec）分子量：12500左右氨基酸残基：100亲源关系越近的，其细胞色素C亲源关系越远的，其细胞色素C24aminoacidresidueB6Cys18insulin治疗人的（diabetes）。三、蛋白质一级结构的差异—分子分子病：突变－功能蛋白氨基酸残基遗传性替代－整个分子的三维结构改变－功能部镰刀型红细胞贫血（sickle-cellanemia）现是由于hemoglobin第6GluValβ.NGlu6β.NValGlu-亲水，Va10在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324释放出48个氨基酸，产生活性凝血酶（thrombin）。A49B259（19）和二个纤维肽B（21），A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，血纤蛋白质单体分子间，形成网状胰岛素原（proinsulin）：前胰岛素原进入内质网腔，信号肽被信号肽酶（signalpeptidase）切除。生成胰岛素原，被运至高尔基体（Golgiappartus）在粒（storage答案：参考知识点3第第五节多肽与蛋白质的人工C端→N挂接→去保护→中和→缩合→（去保护→中和→缩合）n第三节蛋白质的高级结肽链的二面角（dihedralα碳原子连接的两个键（α-N1α-C2）是单键，能自由旋转。绕α—N1键旋转的角度为Φ绕α—C2键旋转的角度称Ψ当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。从Cα向C2CαC2Ψ角为正值，反之为负值。Φ和Ψ同时为0接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ。拉氏构象图：Ramachandran（non-covelently-bondedatom）间驱使蛋白质折叠的主要动力－熵效应主要有两点：第一在溶剂中的疏水基团降低α螺旋（α-①二面角Φ=57°,Ψ=48②每圈3.6③每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行；肽键上N-H（N）第四个残基上的C=0典型的α螺旋用3.613表示，3.63.61313个原子。封闭环原子数3n+4（n=1、2 （2）RαRαα-螺旋,如多聚Lys、多GlyΦ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，不易形成αRα-螺旋，例如Rα-螺旋的形成,如多聚Phe，在pH7ProαpHα-螺旋的影响多聚L-GluL-αβ-pleatedsheet（β折叠两条或多条伸展的多肽链侧向，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链。β-折叠中所有的肽链都形成链间氢键，侧链RParallel：β-折叠肽链的N端在同一侧。φ=-119°，Ψ=+113°Antiparallel：肽链的极性颠倒，N端间隔相同。φ=-139°，Ψ=+135°肽链出现的180°回折，由第一个氨基酸残基的C=ON-Hβ转角的特征：A.4B.180C.C=ON-HD.C1α与C4α之间距离小于0.7nmE.三、超二级结构（super-secondary结构①βcβx②βαβxα-螺旋，最常见的是βαβαβ回形拓扑结构（希腊一般由5-15条β-折组成缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤维。Cys胶原蛋白3.4.1（如图）： （1） （2）13244122а邻的氨基酸之间垂直距离是0.15nm。该多肽链形成а-螺旋后，其长度=(122/3.6)×0.54=18.3nm0.15×122=18.3nm。计算一个含有78个氨基酸残基的多肽，若呈a-螺旋状态，其长度是多少nm,若呈βnm?呈β78*0.36=28.1某蛋白质多肽有一些区段为a-螺旋状态。另一些区段为β-折叠构象，该蛋白质相对2400005.06*10^-5cm计算多肽链中a-螺旋构象占分子长 120240000/12=2000个。设有Xa-螺旋结构，则：X*0.15+(2000-X)*0.36=5.06*10^-5*10^7=506nm计算后：X=1019，a-螺旋的长度为1019*0.15=152.9答案：多聚赖氨酸的赖氨酸侧链是氨基，在ph=7是带有正电荷，所以由于静电的斥力作用使多聚赖氨酸不能形成a-螺旋结构。当在ph=10时赖氨酸侧链的氨本不解离，排 12.质中12.质中疏水作 13L中呈аL13L中呈аLBL-亮氨酸中的肽键有所不同C、C、 链的氨基酸残基：Asp、Lys、HisCys，因其常常参与链内和链间的二硫键的形成，使其极性第第六节球状蛋白质的结构多肽链的二级结构由RThrRNase结构域（）：在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成结构域（F.结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出。EFHelix-Loop-Lelix锌指：DNA，2His、2CysZn（一）定向效应：极性基团间色散效应：非极性基团间肌红蛋白分子大小：4.5×3.5×2.5nm153多肽主链由8α-螺旋组成，最长的α-螺旋有237解离平衡：MbO2Y=0.5PO2=K，解离常数KP50，即肌红蛋白多个具有三级结构的亚基，通过非共价键形成的特定构象。多个亚基成四级结构的优势正协同效应：一种配基的结合促进后续配基的结合，S成人：HbA，α2β2，98%HbA2，α2δ2，2%：HbA；HbA2；HbF，α2γ2。大不同，141个氨基酸残基中有20多个相同。B.型曲线。肺泡氧压Po2=100torr，血红蛋白P50=26torr，Y=0.97。肌肉毛细血管Po2=20torr，肌红蛋白P50=1torrY=0.25。释放氧：△Y=0.97-0.25=0.72C.（Bohr）CO2pH波耳效应：增加CO2pH，能显著增强血红蛋白亚基间的正协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放。高浓度的O2CO2血红蛋白是一个别构蛋白，DPGDPG，P50=1torr时，P50=26torrDPGβ亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，降低脱氧血红ABCD液中 液中 列11 3. 1.04.95.8（1）pI4.9＜pH6.0（3）αpI5.8＞pH5.06.6.如果不采取措施 可能被窒抗原决定簇（antigenicdeterminant）抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B多样性：几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，内约有108种抗体，任一时刻约有10000种。抗体是2价的，抗原是多价的WesternBlotting：抗原与抗体的杂交，是研究克隆表达产物、鉴定克隆株的常用技可解离基团主要是侧链基团，少数NNH2CCOOH与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+）pH强酸、强碱；；去污剂；还原剂（β-硫基乙醇）；盐析、盐溶；重金属离子；温溶解度差异：PEG沉淀法、沉淀法、等电点沉淀分钟、稳定亲和层析法（affinitychromatography）：目的蛋白与一种配基特异结合。配基是能与目（机械、渗透、反复冻融、超声波、酶法）粗分离（盐析、等电点沉淀、沉淀、超滤、吸附）

电泳法SDS 层析法凝胶过滤层离心法：Pr 考马斯亮蓝：Pr(10-100μg/ml)-- 双缩脲法：双缩脲 1 1 卵清蛋白（pI=4.6），， C材料 材料 。2060 性材料 “（ 材料 （1）（1） 构成。 ；你 因 （1）用什么试剂，可把此蛋白质裂解成片段？（2）如果裂解的片段分子量均在10000（5）如何证明它们在该蛋白质内答案：可以用Br3可用肽链的末端测定加以鉴定：其中有一段肽的NC应与原始样品相同，而其他两段肽的C5.一段N肽则是样品肽链的NCC相同的肽段为样品肽链的CCN A、半胱氨 DN3、在pH5.12时进行电泳，哪种蛋白质既不向正极移动，也不向负极移动？C D、清蛋白 6、朊是什么？A B、没有蛋白质外膜的性 8、考虑两者的关系和有关氨基酸-蛋白质和脂肪酸-甘油三酯的4种叙述左右左右A（1（2（3（4） B（2（3（4）C（3（4） E、只有9、苯尿症是人的一种隐性遗传疾病，引起氨基酸代谢紊乱。苯尿症引起：B 11、按照R-的极性可把氨基酸分成几类，在表中用代码依R基的极性把下述的氨、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷9、天冬氨酸R有极性，但RR7蛋白质变性后的表现：①生物学活性； 某说他们的补品中含17种氨基酸，有几种是必须氨基酸。你读了这个有何感答案这一不科学。首先 是Ile大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达答一个外源的产物并保持第一一、氨基酸（aminoacid）：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一必需氨基酸（essentialaminoacid）：指人（或其它脊椎动物）（赖氨酸，苏氨酸非必需氨基酸（nonessentialaminoacid）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简等电点（pI,isoelectricpoint）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分茚三酮反应（ninhydrinreaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成肽键（peptidebond）:一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合，除去一分子肽（peptide）:两个或两个以上氨基通过肽键共价连接形成的聚合物蛋白质一级结构（primarystructure）：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列层析（chromatography）:（可以是气体或液体）之间的分配离子交换层析（ion-exchangecolumn）：用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography）：也叫做分子排阻层析