天然药物提取工艺糖类提取工艺

天然药物提取工艺糖类提取工艺第1页/共80页第四章糖类提取工艺第2页/共80页基本要求

了解碳水化合物/糖的概念和知识，糖的分类，多糖的各种生理活性；熟悉糖类的性质和鉴定方法，掌握糖类的提取方法和分离。熟悉多糖纯度检验和结构分析。实例

第3页/共80页第一节概述糖类不仅是生物体内的贮藏养料，而且是生物合成其他有机化合物的前体。作为一种细胞分子表面“识别标志”，参与体内生理和病理过程；21世纪对多细胞生物高层次生命现象研究的重要内容之一。第4页/共80页第一节概述糖类又称为碳水化合物(carbohydrates)一般由碳、氢、氧三种元素构成，而且分子中氢与氧的原子数之比为2:1，与水(H2O)中比例相同，糖类物质的分子式通式可用Cn(H2O)n表示第5页/共80页（一）、糖的分类

按照组成糖类的糖基个数：单糖：单糖是构成各种糖分子的基本单位。

低聚糖：(寡糖),由2-9个单糖分子聚合而成。多聚糖：由10个以上单糖分子聚合而成，通常由几百甚至几千个单糖分子组成。第6页/共80页单糖：多呈结晶状态、有甜味，易溶于水，可溶于稀醇，难溶于高浓度乙醇，不溶于乙醚、氯仿等低极性溶剂，具有旋光和还原性。单糖在自然界中很少以游离状态存在，在营养学上比较重要的有戊糖（五碳糖）和己糖（六碳糖）。己糖中最有营养意义的是葡萄糖、果糖和半乳糖。第7页/共80页第8页/共80页低聚糖：结晶性、有甜味，易溶于水，难溶于极性有机溶剂，易被酶或酸水解成单糖而具有旋光性；当分子中有游离醛基和酮基具有还原性，没有则不具有还原性。低聚糖目前发现的为2-5个单糖分子的低聚糖，分别称为双糖（蔗糖、麦芽糖）和三糖（甘露三糖、龙胆三糖）等，在植物体内分布最广的蔗糖。第9页/共80页蔗糖(sucrose)：由一分子葡萄糖和一分子果糖通过糖苷键连接而成，无还原性。

乳糖(lactose)：半乳糖和葡萄糖结合而成。存在与哺乳动物的乳汁中。

麦芽糖(maltose)：两分子葡萄糖由糖苷键连接，具有还原性。第10页/共80页多糖的分类：均一多糖：由一种单糖组成的多糖；

淀粉—植物细胞（谷粒，块根，果实）

糖原—动物细胞（如肝细胞中的糖原）

纤维素—植物细胞（木材50%，棉花90%）非均一多糖：由二种以上单糖组成的多糖；透明质酸，软骨素第11页/共80页多糖的性质：多糖大多为无定形化合物，相对分子质量较大，无甜味和还原性，难溶于水，在水中的溶解度随分子量增大而降低多糖被酶或酸水解为单糖，具有旋光性和还原性第12页/共80页（二）、多糖类药物的功能：1.调节免疫功能主要表现为影响补体活性，促进淋巴细胞增生激活或提高吞噬细胞的功能，增强机体的抗炎、抗氧化和抗衰老的能力。第13页/共80页（二）、多糖类药物的功能：2.抗感染作用可提高机体组织细胞对细菌、原虫、病毒和真菌干扰的抵抗能力。

如：甲壳素对皮肤伤口有促进愈合作用3.促进细胞增殖和生长

通过促进细胞DNA、蛋白质合成，可促进细胞增殖和生长。第14页/共80页多糖类药物的功能：4.抗辐射损伤作用

茯苓多糖、紫菜多糖等有抗Co-γ射线损伤的作用5.抗凝血作用（肝素，天然凝血剂）6.降血脂、抗动脉粥样硬化作用。小分子肝素等具有降血脂、降胆固醇作用7.其他作用第15页/共80页真菌多糖的主要生物活性和功能：1.激活巨噬细胞巨噬细胞在抵御各种干扰和抗肿瘤方面具有主要作用，因而激活巨噬细胞可提高机体抗病能力。如：香菇多糖、灵芝、银耳、黑木耳、冬虫夏草等真菌中分离提取的多糖第16页/共80页真菌多糖的主要生物活性和功能：2.激活淋巴细胞癌症和艾滋病患者由于化疗和放疗使体内免疫系统遭到严重破坏，而多糖化合物可部分恢复并加强患者的免疫功能。如：灵芝、银耳、蜜环菌、冬虫夏草等真菌中提取的多糖都能在体外显著增强ConA诱导的淋巴细胞增殖第17页/共80页真菌多糖的主要生物活性和功能：3.促进干扰素（IFN）的生成

香菇多糖体内给药12小时后，能促进血浆中的IFN的浓度达到高峰如：香菇多糖、灵芝、黑木耳、冬虫夏草等真菌中分离提取的多糖第18页/共80页真菌多糖的主要生物活性和功能：4.诱生肿瘤坏死因子5.促进白细胞介素生成6.激活网状内皮系统因此，在临床上具有抗肿瘤，抗衰老，降血压，血脂、血糖，健胃保肝作用。

第19页/共80页香菇多糖注射液

【性状】本品为无色澄明的液体。

【适应症】免疫调节剂，用于恶性肿瘤的辅助治疗。第20页/共80页灵芝多糖胶囊【适宜人群】体虚人群辅助治疗和大众人群防病保健，增强体质。

第21页/共80页第二节糖类提取工艺特点一、糖类的溶解性与性质鉴定1.糖类的溶解性根据要提取的糖类的性质及原料中其他组分的特性，要从生物中直接提取糖类宜用水或稀醇。根据在水和乙醇中的溶解度不同，可分为六类

第22页/共80页第二节糖类提取工艺特点根据在水和乙醇中的溶解度不同，可分为：易溶于冷水和温乙醇：

包括各种单糖、双糖、三糖和多元醇类。易溶于冷水，不溶于乙醇：

果胶和树胶类物质，常以钙镁盐形式存在易溶于温水、难溶于冷水、不溶于乙醇：

包括黏液质，如木聚糖、菊糖、糖淀粉等第23页/共80页根据在水和乙醇中的溶解度不同，可分为：难溶于冷水、热水，可溶于稀碱：包括水不溶胶类，总称半纤维素，如甘露聚糖等不溶于水和乙醇、部分溶于碱液：包括氧化纤维素类，可溶于氢氧化铜的氨溶液在以上溶剂中均不溶：如纤维素等第24页/共80页2.糖类的性质鉴定a.苯酚-硫酸法(棕色环试验法）：试剂可与游离或多糖中的戊糖、己糖中的醛酸起显色反应。测试：在样品溶液中加入苯酚，摇匀，再沿壁滴加浓硫酸，发现有棕色环出现，表明含有糖类化合物。b.蒽酮-硫酸法：糖类化合物与硫酸发生脱水称糠醛及其衍生物，然后与蒽酮缩合变成绿色物质。第25页/共80页2.糖类的性质鉴定c.费林试剂反应：具有还原性的糖可用将铜试剂还原称氧化亚铜红棕色沉淀而多糖无还原性，但在无机酸条件下，水解成具有还原性的单糖；可由此反应判断单糖还是多糖d.成脎反应：成糖脎是多糖的特征反应第26页/共80页天然多糖主要是从植物或农副产品中提取分离而得到的常用方法：热水浸提法酸碱浸提法酶法等二、糖类提取方法第27页/共80页水作为溶剂浸取多糖，温度一般控制在50-90℃，恒温水浴回流浸提2-4h；过滤得滤液和滤渣；滤渣再用水在相同条件下反复浸取3-5次；合并滤液，将其在恒温水浴上浓缩挥发除去绝大多数水；然后边搅拌边加入适当的2-5倍体积的乙醇，多糖呈絮状沉淀析出，离心分离，用适量丙酮或乙醚洗涤脱水；再真空干燥或直接冷冻干燥即得粗多糖。1.热水浸提法第28页/共80页优点：操作简单缺点：水为溶剂浸提，难以完全溶出其中的多糖物质，需反复多次浸提，操作时间长，收率低注意：易溶于水的多糖，注意温度是否破坏结构。如：水溶性的螺旋藻多糖不宜用热水浸提1.热水浸提法第29页/共80页2.酸浸提法该法的浸提是在酸性条件下完成，操作如下：向原料中加盐酸溶液，使其最终浓度为0.3mol/L，然后置于90℃恒温水浴中浸提1-4h，用碱中和后过滤，滤渣加盐酸反复浸提2-3次，最后合并滤液；浓缩，用95%乙醇沉淀、分离、洗涤脱水、干燥得粗多糖。第30页/共80页3.碱浸提法向原料中加NaOH溶液，使其最终浓度为0.5mol/L，然后置于90℃恒温水浴中浸提1-4h，用酸中和后过滤，滤渣加碱反复浸提2-3次，最后合并滤液；浓缩，用95%乙醇沉淀、分离、洗涤脱水、干燥得粗多糖。第31页/共80页注意：酸碱浸提由于酸碱浓度因子难以控制易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构，减少多糖得率。第32页/共80页4.酶法该法先用蛋白酶分解除去大部分蛋白质，再从溶液中浸提多糖可以使浓缩工艺和后续的脱蛋白工艺操作变得简易、省时，提高粗多糖的得率。第33页/共80页5.超声波提取法：利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高糖类在提取液中的溶解度和浸出率，从而可提高多糖的提取率。操作时，先将原料放入浸提液中，经超声波处理一段时间后，过滤，即得糖类提取液。第34页/共80页6.超临界萃取法：利用CO2等气体在超临界的条件下呈现出特殊的液相特征，来提取原料中的糖类物质。这种方法对物质活性的保存率很高，但成本较高，目前大多用于价值较高的成分的提取。第35页/共80页7.影响糖类提取的因素主要因素是原料提取工艺条件分离工艺等

第36页/共80页7.影响糖类提取的因素原料：品种不同，多糖含量不同；一般选择含量较高的原料品种提取工艺条件：应根据具体生产环境和设备条件，通过试验确定其最佳工艺条件；第37页/共80页浸提料液比：料液比的上升会增加多糖的溶出量，到达一定的比例后，上升幅度明显下降，且会对后续工艺造成不良影响，降低生产效率。温度对灵芝多糖提取有显著影响，温度上升提取率显著上升，一般80-100度理想。浸提时间：随着热提时间增加，多糖提取率增加，但增加趋势趋缓，时间过长，提取率有下降趋势；且受热时间过长，多糖的糖苷键会断裂导致多糖含量降低第38页/共80页7.影响糖类提取的因素分离工艺的影响采用水提醇沉工艺时，有机溶剂的浓度、加入量等因素会对提取率造成一定的影响。采用膜分离工艺时，膜材料、分离顺序、压力等因素都会对提取率产生直接影响。第39页/共80页三、糖类的分离1.水提醇沉法

常用的多糖提取工艺。是利用多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，从不同材料中进行提取。提取时一般先将原料物质脱脂与脱游离色素，然后用水或稀酸、碱、盐溶液提取，提取液浓缩后即以等重或数倍的甲醇、乙醇、或丙酮等沉淀析出，得粗多糖。第40页/共80页三、糖类的分离1.水提醇沉法

常用的多糖提取工艺优点：水对设备要求不高，一次性投入较小；缺点：劳动强度大，工艺繁杂，不能连续生产，生长效率低，所获产品活性损失大；且生产中产生的废料造成污染。第41页/共80页2.膜分离法与透析法膜分离是利用多糖相对分子量大小，在通过半透膜时，实现机械分离。然后再低温浓缩、干燥得粗多糖。优点：采用低温工艺，对多糖体活性保存较好，能耗低，速度快，费用省，在生长过程中不产生污染；缺点：对设备要求高，管理水平要求也高。第42页/共80页2.膜分离法与透析法透析法是利用一定大小孔目的膜，使无机盐或小分子糖透过而达到分离目的的方法。注意：选择合适的膜非常重要。纤维膜孔小于2-3nm，适用于糖类，可使单糖分子通过；孔目稍大的3-5nm，小分子透过加速，多糖留在不透析部分。透析在逆相流水中进行或需经常换水，pH保持在6.0-6.5，时间可达数天，透析液浓缩后可用乙醇沉淀多糖第43页/共80页3.分级沉淀法利用随着聚合度的增大，糖类在醇中的溶解度逐步降低的性质。在糖的高浓度水溶液中，分次加入乙醇，使醇浓度逐步增加50、100、150/L等,分别取出在每个醇浓度析出的沉淀，作图，粗略确定适宜糖类大量析出的醇浓度。注意：采用此法时，一般应将提取液的pH调至7.0左右；酸性多糖调至2-4。缺点：此法只适合糖类的粗略分离，要获得均一组分，需反复使用同一种方法或综合使用多种方法。第44页/共80页4.活性炭柱层析法此法适合于分离低聚糖的混合物。通常用活性炭和硅藻土的等量混合物柱层析法进行糖液分离。在此，硅藻土有利于层析时洗脱液的通过也可用40-60目的颗粒状活性炭装柱第45页/共80页5.凝胶过滤法主要是利用具有三维网状的多孔性凝胶来进行糖类的分离（凝胶孔径的大小取决于形成凝胶时的交联程度）。当含有待分离的物质溶液流经凝胶柱时，小分子成分易扩散进入空中，而大的不易进入孔中；洗脱时，分子量从大到小一次流出。特别适用于分离具有不同聚合度的糖。且快速、简单、条件温和。第46页/共80页6.离子交换树脂层析法阴离子交换树脂AmberlitIR-400，用NaOH处理过后，可用选择性地吸附还原糖，完全不吸附糖醇和苷，而部分吸附蔗糖。所有的糖都可用100g/LNaCl溶液洗脱出。阳离子交换树脂可用于酸性糖类和中性糖类的分离。中性糖类的多羟基结构与硼酸络合酸性酯后，也可用离子交换树脂进行分离。强碱性阴离子交换树脂Dowex-1对分离双糖有不同的吸附力，可以分离蔗糖、麦芽糖和乳糖等；此方法效率高，但洗脱体积大，后处理麻烦。第47页/共80页7.季铵盐沉淀法阳离子型清洁剂，如十六烷基三甲铵盐（CTA盐）和十六烷基吡啶盐（CP盐）等和酸性多糖阴离子可用形成不溶于水的沉淀，从而使酸性多糖从水溶液中沉淀出，而中性留存在母液中。再利用硼酸络合物，使中性多糖沉淀下来。通过将十六烷基三甲铵溴化物(CTAB)顺次加入不同pH的多糖水溶液中，就可在酸性、中性、微碱性、强碱性的溶液中分布沉淀出，达到分离目的。第48页/共80页7.季铵盐沉淀法根据沉淀物的性质，分为三种：沉淀溶于无机盐溶液：将沉淀物加入4mol/L的NaCl或KCl溶液中，如溶解，则表示该多糖已转化为钠盐或钾盐，可直接加入3-5倍乙醇使多糖沉淀下来，季铵氯化物就会留在上清夜中；成钠盐的糖可用盐酸处理，使其恢复为游离糖；最后再以透析或冷冻干燥法获得多糖第49页/共80页7.季铵盐沉淀法沉淀溶于有机溶剂：使沉淀溶于乙醇或丙酮，在溶液中加NaCl，NaAc等无机盐。添加时，先将无机盐溶于乙醇或制成很浓的水溶液。加入盐后，多糖以钠盐沉淀下来，再加盐酸，恢复游离多糖。盐水和有机溶液均不溶：沉淀加入无机盐的醇饱和溶液中，多糖在沉淀里，用醇洗去无机盐后，加酸恢复多糖。第50页/共80页8.金属离子沉淀法铜盐沉淀法可用CuCl2，CuSO4，Fehling试剂、乙二胺铜试剂。常用的方法为Fehling试剂和醋酸铜乙醇法第51页/共80页8.金属离子沉淀法醋酸铜乙醇法：在多糖水或NaOH溶液中添加70g/LCu(Ac)2溶液直至沉淀多糖完全。离心分取沉淀后，离心液加Cu(Ac)2溶液和足量乙醇，得第二次沉淀。反复分级获得各种多糖的铜复合物，再分别用50ml/LHCl的乙醇溶液分解游离多糖。第52页/共80页8.金属离子沉淀法氢氧化钡沉淀法饱和的Ba(OH)2溶液可使树胶类多糖沉淀，特别容易使D-甘露聚糖沉淀下来，从而与木聚糖分离开来。葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和其他甘露聚糖在氢氧化钡浓度低于0.03mol/L时几乎可用沉淀完全。而阿聚糖、半乳聚糖在任何浓度的Ba(OH)2溶液中均不沉淀。第53页/共80页9.糖类提取液除蛋白质和脱色原料中大量的蛋白质，除去它是一个重要的环节常用的方法：Sevage法三氟三氯乙烷法三氯乙酸法(TLA)第54页/共80页Sevage法：用氯仿：戊醇5:1或4:1的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧烈振摇20-30min，蛋白质变性形成胶状，离心后处于氯仿和水二层中间，从而得以除去。加速蛋白质的变性，可用pH4-5的缓冲液代替水，并加入少量的正丁醇或正戊醇。缺点：重复多次才可除尽蛋白质，损失较大改进：可用酶法除去大部分蛋白质，再用此法除去剩余蛋白质。第55页/共80页三氯乙烷法：按多糖溶液：三氯乙烷1:1的比例配成溶液加入，在低温下搅拌约10min，离心得上层水层，水层继续同法处理几次即得。优点：效率高。缺点：溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。第56页/共80页三氯乙酸法（TLA）：在多糖溶液中滴加30g/L三氯乙酸，直至溶液不再继续浑浊为止，在5-10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的多糖溶液。缺点：会引起某些多糖的降解。第57页/共80页四、多糖的纯度检验和结构分析单糖组分的分析：气相色谱GC、液相色谱HPLC，毛细管电泳法常用于单糖组分的分析。糖苷键类型及连接方式：甲基化、高碘酸氧化和smith降解、乙酰解、核磁共振、质谱等分析方法。多糖高级结构：采用物理方法，如：X射线，纤维衍射法，电镜法等。第58页/共80页1.产品的纯度检查采用玻璃纤维纸电泳对其进行纯度检查：用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检查法检查采用HPLC法检测：第59页/共80页2.多糖的结构分析分析手段有物理方法和化学方法：物理方法常用的有：1.GC和GC-MS联用：用于测出多糖的组成，及各单糖之间的摩尔比，此法要求样品具有一定的挥发性，待测样品多需制备成硅烷衍生物和乙酰化衍生物等第60页/共80页2.核磁共振光谱（NMR）法：用于确定多糖结构半糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。一般用1HNMR测定简单多糖，

13CNMR测定复杂的多糖。3.紫外光谱法：在260-280nm处用于检测多糖中是否含有蛋白质、核酸、多肽类。第61页/共80页4.红外光谱法：用于确定吡喃糖的糖苷键构型及其他官能团。一般多糖类物质的特征吸收峰为：3440cm-1处为-OH的吸收振动峰；2935cm-1处为C－H的伸缩振动吸收峰；1510－1670cm-1之间的吸收峰为C=O的振动峰;1410cm-1处为C－H的弯曲振动吸收峰；1090cm-1处为吡喃环结构的C－O的吸收峰等。第62页/共80页2.多糖的结构分析化学方法常用的有：酸水解：完全水解和部分水解法

用于鉴定多糖中单糖组分或多糖中的低聚糖。其他的还有甲基化反应、碱降解等方法。第63页/共80页第三节糖类提取实例单糖的提取（D-甘露醇的提取）D－甘露醇的作用：

降低颅内压，使由脑水肿引起休克的病人神志清醒；用于大面积烧伤及烫伤产生的水肿；有利尿作用，用以防治肾脏衰竭；降低眼内压、治疗急性青光眼；还用于中毒性肺炎，循环虚脱症等。在海藻、海带中的含量较高，是提取甘露醇的重要来源。第64页/共80页甘露醇注射液

MannitolInjection本品主要成分及其化学名称:D-甘露糖醇。

【性状】本品为无色的澄明液体。【适应症】

（1）组织脱水药。用于治疗各种原因引起的脑水肿，降低颅内压，防止脑疝。（2）降低眼内压。可有效降低眼内压，应用于其他降眼内压药无效时或眼内手术前准备。（3）渗透性利尿药。用于鉴别肾前性因素或急性肾功能衰竭引起的少尿。亦可应用于预防各种原因引起的急性肾小管坏死。（4）作为辅助性利尿措施治疗肾病综合征、肝硬化腹水，尤其是当伴有低蛋白血症时。（5）对某些药物逾量或毒物中毒（如巴比妥类药物、锂、水杨酸盐和溴化物等），本药可促进上述物质的排泄，并防止肾毒性。（6）作为冲洗剂，应用于经尿道内作前列腺切除术。（7）术前肠道准备。第65页/共80页(1)工艺流程海藻或海带浸泡提取自来水浸泡液凝集黏性物pH10-11,8h上清液中和pH6-7中性提取物浓缩110－115℃浓缩物乙醇沉淀95%乙醇沉淀物乙醇回流除杂质精制水，活性炭干燥105-110℃粗品甘露醇结晶甘露醇药用甘露醇第66页/共80页（2）工艺过程及控制要点浸泡提取、碱化、中和：加20倍量水，室温下浸泡2-3h，浸泡液套用作第二批原料的提取溶剂，一般套用4批，浸泡液中的甘露醇含量已较大。去浸泡液用300g/LNaOH，调pH为10-11，静置8h，凝聚沉淀多糖类黏性物。虹吸上清液，用500ml/LH2SO4中和至pH6-7，进一步除去胶状物，得中性提取物。第67页/共80页（2）工艺过程及控制要点浓缩、沉淀：沸腾浓缩中性提取液，除去胶状物，直到浓缩液含甘露醇300g/L以上，冷却至60-70℃趁热加入2倍量950ml/L乙醇，搅拌均匀，冷却至室温，离心收集灰白色松散沉淀物。第68页/共80页（2）工艺过程及控制要点精制：取含量大于900g/kg的样品溶于适量蒸馏水中，加入活性炭，80℃保温0.5h，滤清清液冷却室温，结晶、抽滤、洗涤得精品甘露醇。干燥：105－110℃烘干。包装：无菌包装。第69页/共80页大豆低聚糖（soybeanoligosaccharides):

大豆中可溶性寡糖的总称，主要成分是蔗糖、绵子糖、水苏糖及少量的毛蕊花糖。大豆低聚糖的作用：

促进双歧杆菌的增殖，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生，已知病原菌和腹泻，防止便秘，保护肝脏，降低血清胆固醇，佳果的血压，增强免疫力，抗肿瘤，低能量或无能量，对人体安全等特性。低聚糖的提取（大豆低聚糖的提取）第70页/共80页（1）提取工艺流程大豆乳清除蛋白取上清液，进行超滤脱色浓缩离心除去残余的蛋白脱盐产品大豆蛋白的去除：工业上是