GABA代谢酶作用的研究

Q808对GABA代谢酶作用研究GABA代谢酶作用的研究第1页GABA介绍γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中主要抑制性神经递质，约50%中枢突触部位以其作为递质。主要经过与其三种特意性受体结合发挥主要生理活性。GABA主要分布于脑内，外周神经和其它组织中极少。GABA在脑内含量很高，约为单胺类递质1000倍以上。GABA在神经未梢脑浆中合成后，由囊泡膜GABA转运体输入囊泡。GABA在作用于突触后膜受体后，快速被突触前、后神经元和突触间隙周围胶质细胞摄取，终止其作用。GABA代谢酶作用的研究第2页GABAGABAC:Cl通道GABAb

K通道G蛋白Ca通道激活抑制GABA传递GABAa:电压门控Cl通道拟GABA作用（直接开放Cl通道）代谢酶：GABA转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶与GABA结构同源与α2δ受体（电压依赖性Ca通道）结合抑制Ca通道抑制Na通道作用于突出囊泡蛋白谷氨酸GAD抗癫痫药机制GABA代谢酶作用的研究第3页GABA受体分为GABAA、GABAB

和GABAC

三种型。GABAA

受体和GABAC受体都是由GABA门控氯离子通道。GABAB受体是与G蛋白偶联受体，激活后经过胞内信号转导系统调制离子通道活动。GABA代谢酶作用的研究第4页中枢神经系统GABA受体药理学分型GABA代谢酶作用的研究第5页GABAA受体-Cl-通道复合物模型图

产生IPSP，抑制突触后神经元兴奋性。GABA代谢酶作用的研究第6页GABA代谢酶

脑内生成GABA代谢通路称为GABA支路(GABAshunt)。第一步反应α-酮戊二酸经转氨基反应生成谷氨酸；随即经谷氨酸脱羧酶(GAD)催化生成GABA；GABA经过GABA转氨酶(GABA-T)催化生成琥珀酸半醛(SSA)；活力极强琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)催化，使琥珀酸半醛快速氧化成琥珀酸，这么又回到了三羧酸循环。GABA代谢酶作用的研究第7页GABAshunGABA代谢酶作用的研究第8页GABA-TGABA-T在组织中分布广泛，所以能快速地由中枢和外周组织代谢，需磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶。PLP与GADA-T结合要愈加紧密一些。最适PH8.2。GABA大多是在神经元外细胞间或突触后神经元中进行代谢。GABA代谢酶作用的研究第9页SSAD

对底物有高度特异性，此酶专一地催化琥珀酸半醛脱氢氧化成琥珀酸，其辅酶是NAD+。最适PH9.2。SSADH高活性，使得即使在GABA代谢活跃脑组织中也极难检测出琥珀酸半醛这个中间代谢物。GABA代谢酶作用的研究第10页GABA-T抑制剂

经过血脑屏障并选择性抑制GABA-T是一个设计癫痫药有效方法。

GABA-T抑制剂主要是GABA类似物，也包含少许特殊结构化合物：1)Vigabatrin类似物2)取代氨基戊酸类似物

3)取代氨基丁烯酸类似物4)其它类型抑制剂:肼衍生物是很多辅酶为PLP酶抑制剂。GABA代谢酶作用的研究第11页

Q808对GABA-T和SSADH抑制作用

材料与仪器试验方法GABA代谢酶作用的研究第12页材料与仪器药品与试剂对羟基苯甲醛(Sigma)，GABA(Fluka)，琥珀酸半醛(Fluka)，α-酮戊二酸(上海三爱思试剂有限企业)，NAD+(Sigma企业)，甘露醇(上海三爱思试剂有限企业)，蔗糖(上海三爱思试剂有限企业)，HEPES(Amresco)，EGTA(Amresco)，牛血清蛋白(Amresco)，焦磷酸钠(天津科密欧化学试剂开发中心)，EDTA(天津科密欧化学试剂开发中心)，磷酸钾(天津科密欧化学试剂开发中心)。其余为国产分析纯或化学纯试剂。GABA代谢酶作用的研究第13页仪器荧光分光光度计：FL-4500，Hitachi，Japan；冷冻离心机：Z323K，Hermle，Germany；电子恒温水浴锅：HHS-2S，光地仪器设备有限企业，上海；电子天平：BS300S，赛多利斯天平有限企业，北京；超低温冰箱：U410，NewBrunswickScientificCo.,Inc.，USAGABA代谢酶作用的研究第14页试验方法

GABA-T制备按照简化Churchich方法[159]从成年雄性Sprague-Dawley大鼠分离GABA-T。除了尤其说明，纯化步骤在4°C进行而且全部缓冲液都含有0.1mmo/LEDTA和1mmol/Lβ-巯基乙醇。大鼠用乙醚深度麻醉后取脑。以含1mmol/Lα-酮戊二酸10mmol/L磷酸钾(pH7.4)缓冲液制备脑匀浆(每个大脑约4mL匀浆)。在该匀浆中慢慢加入1mol/L乙酸调整pH值到5.5，50°C下加热5min，冷却至4°C后，以10000×g离心30min。弃去沉淀后，上清液用(NH4)2SO4处理。加入(NH4)2SO4达40-75%饱和度时产生沉淀，离心后沉淀溶于0.01mol/L乙酸钠缓冲液，保留在-80℃冰箱中备用。GABA代谢酶作用的研究第15页

SSADH制备按照Nguyen方法[160]略作修改从成年雄性Sprague-Dawley大鼠分离SSADH。分离缓冲液含有甘露醇(0.21mol/L)，蔗糖(70mmol/L)，HEPES(5mmol/L)，EGTA(1mmol/L)，和牛血清蛋白(BSA1mg/mL)，pH=7.4，4℃下保留。大鼠用乙醚深度麻醉后取脑匀浆。匀浆液(每个大脑约40mL)在4℃下以3000×g离心2min，弃去沉淀物。上清液在4℃下以1×g离心10min。将沉淀物重新悬浮在10mL不含牛血清蛋白分离缓冲液中，并在4℃下以1×g离心10min。最终沉淀物悬浮在0.5mL不含牛血清蛋白分离缓冲液中，保留在-80℃冰箱中备用。GABA代谢酶作用的研究第16页GABA-T活性检测GABA-T活性采取修改Qiu方法[21]检测。标准检测缓冲液含有磷酸钾(0.1mol/L)，NAD+(500μmol/L)和上述制备SSADH，pH=8.5。检测时，将GABA，α-酮戊二酸，上述制备GABA-T，以及药品加入到检测缓冲液中，在37?C下温孵30min。使用HitachiFL-4500荧光分光光度计检测NADH产生量(激发波长为355nm，发射波长为459nm)。以不加药品时NADH产生量为对照(C)，以不加GABA、α-酮戊二酸及药品时NADH产生量为空白(B)。经过公式计算得到GABA-T活性：%GABA-T=(A-B)/(C-B)，其中A为加药品时NADH产生量。GABA代谢酶作用的研究第17页SSADH活性检测SSADH活性使用略加修改Chambliss方法[161]检测。标准检测缓冲液含有焦磷酸钠(0.1mol/L)，EDTA(1mmol/L)和NAD+(500μmol/L)，pH=9.0。检测时，将琥珀酸半醛，上述制备SSADH，以及药品加入到检测缓冲液中，在25?C下温孵30min。使用HitachiFL-4500荧光分光光度计检测NAD