抗体制药专题知识专家讲座

McAb在免疫导向疗法中存在困难（障碍）：

A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5~6h，难以维持有效药品作用靶组织时间；

B、完整抗体分子相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。处理问题方法或路径—基因工程技术

A、降低McAb免疫源性；

B、降低McAb相对分子质量。抗体制药专题知识专家讲座第1页5、1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等各种类型，基本上消除了抗体鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子1/80~1/3。

6、1994年Winter创建了噬菌体抗体库技术,以基因工程方法制备抗体并发展成抗体工程。它是抗体研究领域一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。抗体制药专题知识专家讲座第2页第二节单克隆抗体及其改造（MonoclonalAntibody）一、制备单克隆抗体普通流程

McAb是将抗体产生细胞与含有无限增殖能力骨髓瘤细胞融合，经过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一单克隆细胞系而产生。因为这种抗体是针对一个抗原决定簇抗体，又是单一B淋巴细胞克隆产生，故称为单克隆抗体。抗体制药专题知识专家讲座第3页抗体制药专题知识专家讲座第4页抗体制药专题知识专家讲座第5页

1、抗原与动物免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠

2、细胞融合与杂交瘤细胞选择培养

基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107~3×107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液迟缓稀释。抗体制药专题知识专家讲座第6页抗体制药专题知识专家讲座第7页

用于细胞融合骨髓瘤细胞条件：1、融和率高2、本身不分泌抗体3、所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强且长久稳定。抗体制药专题知识专家讲座第8页PEG相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞毒性也随之增大。惯用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内PEG都能使细胞发生融合。

为了提升融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亚砜），以提升细胞接触紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。（1）细胞融合液中细胞类型：4或5种。（2）怎样去除脾-瘤融和细胞以外细胞？惯用选择性培养基抗体制药专题知识专家讲座第9页抗体制药专题知识专家讲座第10页

细胞融合后，可产生各种融合细胞，如脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞，而且还有许多未融合骨髓瘤细胞。这些细胞比脾—瘤融合杂交瘤细胞增殖更加快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后细胞马上移入选择性培养基中进行培养。惯用选择培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成主要路径，瘤—瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾—脾融合细胞和瘤细胞在这么组织培养条件下，几天内亦快速死亡。因为骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，所以脾—瘤融合杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。抗体制药专题知识专家讲座第11页

在最适培养条件下．大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数杂交瘤细胞多半不易存活。

在体外细胞培养中，单个或数量极少细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活细胞才能使其生长繁殖，加入细胞称之为喂养细胞。所以通常要加入喂养细胞才能使其繁殖。惯用喂养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。普通认为喂养细胞能释放一些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能去除死亡细胞，故应用较多。抗体制药专题知识专家讲座第12页3、筛选阳性克隆与克隆化惯用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术惯用克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后克隆化可用不含HTRPMI1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，因为培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。

抗体制药专题知识专家讲座第13页

筛选阳性克隆与克隆化

因为抗体产生细胞只占全部脾细胞5％左右，所以要进行每孔培养上清抗体活性筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。并检测大批标本。免疫酶技术因不需进行放射性核素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采取。经过引入生物素—亲和素等放大系统可深入提升灵敏性。普通说来免疫酶技术和放射免疫技术均适合用于可溶性抗原及颗粒性抗原抗体检测。免疫荧光技术适合用于细胞抗原抗体检测，尤其是制备以检测患者活检组织标本为目标抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体同时，还能对所识别抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤风毒素抗体为例进行说明。

抗体制药专题知识专家讲座第14页抗体制药专题知识专家讲座第15页4、杂交瘤细胞与抗体性状判定—染色体分析

正常鼠脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，有中部和亚中部着丝点。

杂交瘤细胞染色体数目：靠近两亲本细胞染色体数目标总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。

染色体数目多且较集中杂交瘤细胞分泌高效价抗体；反之，则反。抗体制药专题知识专家讲座第16页5、单克隆抗体大量制备（1）体外培养法：用于抗原免疫性极弱取得抗体较少。多采取RPMI1640培养液，添加10%--20%胎牛或小牛血清。但因为培养液中含有血清成份，总蛋白量可达100µg/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞生长。改良方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可降低污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养细胞密度可达2×107/ml,搜集单克隆抗体可达400µg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108/ml。抗体制药专题知识专家讲座第17页（2）动物体内诱生法：用于抗原免疫性较强。惯用基本程序：接种前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保留杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠各种杂蛋白，给纯化带来难度。抗体制药专题知识专家讲座第18页6、单克隆抗体纯化依据Ig类和亚类以及用途选择不一样纯化方法。

体外诊疗试剂IgG类沉淀处理+亲和层析

IgM类沉淀处理+凝胶过滤体内诊疗试剂或治疗用药亲和层析+阴离子交换层析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量污染物。

抗体制药专题知识专家讲座第19页动物体内诱生法制备McAb纯化普通程序：

（1）澄清和沉淀处理：a.1000g离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）b.20000g高速离心30min,去除残留小颗粒物质c.用0.2µm微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上抗体）。

抗体制药专题知识专家讲座第20页（2）分离

A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。惯用SephadexG200作为分离介质，可搜集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为IgG。抗体回收率达50~80%，能去除污染微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。

B、阴离子交换层析：用于IgG类分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提升产量，但其纯度相对较低。

C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析。适合用于IgG类。IgG类与蛋白A结合与pH有亲密关系。鼠源性单抗在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱下IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获抗体纯度和很高，但也有极微量杂蛋白。抗体制药专题知识专家讲座第21页二、鼠源性单克隆抗体改造

目标：一是降低免疫源性；

二是降低相对分子量，增加组织通透性。

原理：抗体同抗原结合功效决定于抗体分子可变区（V），生物功效则决定于抗体分子稳定区（C）。

抗体制药专题知识专家讲座第22页抗体制药专题知识专家讲座第23页抗体制药专题知识专家讲座第24页抗体制药专题知识专家讲座第25页抗体制药专题知识专家讲座第26页鼠源性单克隆抗体改造

1、人—鼠嵌合抗体（chimericantibody）：把鼠源性单克隆抗体V区基因分离出来，分别与人IgC区基因连接，即成为人—鼠嵌合抗体基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表示出完整ChimericAntibody.2、改型抗体(Reshapingantibody)：用鼠源性单克隆抗体CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人Ig分子含有鼠源性单克隆抗体抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小百分比，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)。

3、小分子抗体：小分子抗体仅表示鼠源性单克隆抗体V区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/80~1/3。

(1)Fab片段抗体：VH+CH1(3)单链抗体：VH-Linker-VL(2)FV抗体：VH+VL(4)单域抗体：VH或VL（5）最小识别单位（MRU）：单个CDR区组成

抗体制药专题知识专家讲座第27页

4、双功效抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是一个非天然性抗体，其结合抗原两个臂含有不一样特异性。

5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功效抗体范围。是20世纪90年代发展研究领域。类型以下：（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.

（2）配基—Ig型嵌合抗体，如IL-2-Ig

（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受体—FV型融合蛋白（5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体制药专题知识专家讲座第28页第三节抗体工程抗体研究三个阶段：①以1890年Behring发觉白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来取得多克隆抗体；②以1975年Köhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；③以1994年Winter完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能经过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库技术,克服了人体不能随意免疫缺点，用人外周血制备抗体文库，从而取得人源性基因工程抗体。抗体制药专题知识专家讲座第29页

一、噬菌体抗体库技术基本方法

1、获取目标基因

2、抗体库技术载体：

3、淘筛（panning）：

4、表示与判定：。抗体制药专题知识专家讲座第30页

1．获取目标基因提取RNA经反转录PCR(RT—PCR)获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区(VH、VL)基因。抗体基因组合形式多为单链抗体SCFV，也用连接链(G4S)3组合成功效分子。抗体制药专题知识专家讲座第31页

2．抗体库技术载体现在普遍使用噬菌粒载体，它含有噬菌体和质粒共同特点。因为它转化效率高有利于提升文库容量。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白形式表示在载体表面，再感染后，能使目标克隆得以扩增。琥珀终止码在适当位置上引人载体是抗体库关键性技术。而克隆位点后基因序列则有利于对可溶性表示产物判定和纯化。抗体制药专题知识专家讲座第32页

3．淘筛基本过程是，抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染取得大容量次级文库，再重复与抗原吸附……，经几轮淘筛后，淘汰了非目标克隆，且使目标克隆大量地扩增。

4．表示与判定目标克隆经过判定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表示。产物用Western-blot分析确定后，就完成了全过程。抗体制药专题知识专家讲座第33页WesternBlotting免疫印迹WesternBlot采取是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识二抗。经过PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应抗体起免疫反应，再与酶或同位素标识第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目标基因表示蛋白成份。该技术也广泛应用于检测蛋白水平表示。抗体制药专题知识专家讲座第34页抗体制药专题知识专家讲座第35页经典印迹试验包含三个步骤：

①蛋白质电泳分离

②电泳后凝胶上蛋白质转移至固体膜上。

③免疫学检测。抗体制药专题知识专家讲座第36页二、噬菌体抗体库技术特点

1、模拟天然全套抗体库：抗体文库能够到达或超出1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏淋巴细胞提取mRNA反转录形成cDNA扩增，这是人体多克隆细胞总mRNA。使用通用引物采自多个人体，含有些人种属普遍性。抗体VH和VL基因随机重组也增加了抗体多样性。

2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：因为抗体库大容量和极高筛选效率，使得能够调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能防止使用人工免疫动物和细胞融合技术。

3、可取得高亲和力人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又来自人体，所以，所产生抗体必定都是高亲和力人源化抗体。抗体制药专题知识专家讲座第37页三、基因工程抗体表示在筛选出阳性克隆后，按其目标不一样，可选取原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不一样表示方式进行表示。

1．原核细胞表示抗体表示，又分融合表示和分泌型表示两种。融合表示有利于反抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性进行判定。分泌型表示则利用琥珀终止密码终止作用，在无琥珀抑制基因菌株中进行表示，形成可溶性抗体就是应用抗体。抗体制药专题知识专家讲座第38页无义突变三种昵称，三个终止密码子UAA叫赭石密码子；UAG叫琥珀密码子；UGA叫蛋白石密码子。琥珀突变（AAG→UAG）就是当ORF中一个密码子突变为琥珀型终止子后，生物体采取了一个办法，原来此密码子对应反密码子也突变为与琥珀密码子配对，从而是ORF阅读后产物和突变后产物一样．这么就对突变进行了抑制．抗体制药专题知识专家讲座第39页

2．真核细胞表示用于表示基因工程抗体真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞表示都是分泌型表示。

3．转基因植物表示抗体基因能转入植物中表示，这方面研究较多且潜力较大是烟草叶中表示．表示抗体称为植物抗体。当前完整抗体分子、单链抗体和Fab片段均已在烟草叶和拟南芥菜植物中得到表示，其产量可达植物叶片总蛋白量1．3％，其高表示产量使抗体成本大幅度下降，而且转基因植物表示可使抗体大规模农业化生产。

4．转基因动物表示即将人Ig基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。当前只在单基因水平上做转基因鼠试验，大基因片段转移难度很大。抗体制药专题知识专家讲座第40页

第四节抗体药品一、抗体诊疗试剂二、抗体治疗药品抗体制药专题知识专家讲座第41页

一、抗体诊疗试剂

抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药品可用于治疗。在体外，因为抗原性状和反应条件不一样，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来判定抗原，做病原学诊疗和血型测定，称为血清学判定。抗体诊疗药品基本分为三类：1、血清学判定抗体制剂。2、免疫标识技术用抗体制剂。3、体内导向诊疗抗体制剂。习惯上体外试验用称试剂，体内导向诊疗用称药品。

抗体制药专题知识专家讲座第42页1、血清学判定用抗体类试剂（1）判定病原菌用抗体试剂

A、惯用诊疗血清品种和用途

B、诊疗血清制备步骤

a、制备细菌抗原：细菌接种培养搜集菌苔-沸水2.5h--制成菌液。

b、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫路径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注射后6-8d取血样测效价，到达要求，即可采血，离心分离血清。

C、诊疗血清诊疗方法：直接凝集反应，镜检抗体制药专题知识专家讲座第43页抗体制药专题知识专家讲座第44页（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）反向被动血凝诊疗试剂

A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化抗HBs血清吸附其上时便含有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。

B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠取得抗HBs血清硫酸铵盐析/柱层析取其IgG在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞洗去多出蛋白成份，用含1%兔血清稀释液稀释至一定浓度，分装即成。

C、诊疗方法：RPHA（reversepassivehemagglutination)反向被动血凝试验，即用纯化抗体致敏醛化血细胞测定对应抗原在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。

抗体制药专题知识专家讲座第45页（3）妊娠诊疗试剂

妇女妊娠后，血液和尿液中HCG含量增高，在3个月内可到达高峰。此时检测尿液中HCG，就可确定是否怀孕（4）抗ABO血型系统血清抗体制药专题知识专家讲座第46页为确保输血安全，供血者和受血者均需检验血型并做血交叉反应。血型有多个系统，其中主要是ABO血型系统。按人红细胞表面带有A或B种凝集原．可将血型分为A、B、AB和O型4种。单克隆抗体是应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A或抗B血清，以判别ABO血型。但单克隆抗体持异性极高，而血型物质又太复杂，易得犯错误结果，其阴性结果往往不能说明没有该血型物质，需用多株单克隆抗体混合才能克服这一缺点。但用单克隆抗体进行血型物质组成研究，则是有用工具。血型判定方法，最惯用是玻片直接凝集方法抗体制药专题知识专家讲座第47页抗体制药专题知识专家讲座第48页2、免疫标识技术用抗体类试剂给抗体标识核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提升。结合显微镜技术，还可反抗原物质作出组织内或细胞内定位测定。除临床诊疗外，还能为探讨发病机制提供伎俩。

（1）荧光抗体诊疗试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标识抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光可视物，从而到达诊疗和定位目标。（2）免疫酶抗体诊疗试剂：用酶标识抗体检验抗原方法

a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊疗试剂

b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊疗试剂

c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊疗试剂

d、测定HIV（人免疫缺点病毒）抗原酶标诊疗试剂

e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊疗试剂用于原发性肝癌辅助诊疗

f、CEA（癌胚抗原）酶标诊疗试剂用于消化道恶性肿瘤判别诊疗抗体制药专题知识专家讲座第49页

免疫酶抗体诊疗技术免疫酶技术是用酶标识抗体来检测抗原方法。

(1)免疫酶染色法（酶标抗体）酶标抗体与抗原发生特异性结合，当加人酶底物时，底物在酶催化作用下发生反应，产生有色物质。该物质不需特殊仪器，在光学显微镜下即能观察。当前惯用酶是辣根过氧化物酶，底物为二氨基联苯胺．二者作用可生成棕褐色沉淀物，使玻片上抗原所在部分呈色。抗体制药专题知识专家讲座第50页

(2)酶免疫测定法酶免疫测定是在液相内微量待检抗原物质定量测定方法。用酶标识已知抗体或抗免疫球蛋白(抗抗体)，与待查抗原混合形成抗原抗体结合物后，加入酶底物进行显色，依据呈色程度使用分光光度计测知待测物质含量。酶联免疫吸附试验(ELSA)是酶免疫测定在方法上一个重大改进，其特点是利用抗原或抗体等蛋内质轻易吸附于聚苯乙烯塑料等表面性质，使抗原抗体反应在塑料管(孔)壁表面上进行，简化了抗原抗体结合物分离手续。本法用途广泛，敏感性高，既可定性检测微量抗原，也可定量测定微生物成份、激素等微量抗原物质。抗体制药专题知识专家讲座第51页抗体制药专题知识专家讲座第52页（3）放射免疫用抗体诊疗试剂

把核素分析高灵敏性与抗原抗体反应特异性两大特点结合起来建立检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平微量抗原物质。

惯用标识抗体试剂：

a、HBsAg放射性核素标识抗体诊疗试剂：125I标识，灵敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素标识抗体诊疗试剂：125I标识，灵敏度0.1ng/ml

。e抗原为阳性表明病毒正在大量繁殖，而且病毒数量比较多，传染性强，需要马上治疗。c、HAV抗原放射性核素标识抗体诊疗试剂：125I标识

d、AFP放射性核素标识抗体诊疗试剂：125I标识，灵敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素标识抗体诊疗试剂：125I标识，灵敏度1ng/抗体制药专题知识专家讲座第53页3、导向诊疗药品因为肿瘤特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药品还未在临床广泛应用。抗体制药专题知识专家讲座第54页（1）．放射免疫显像优点：①在体内有确切定位肿瘤作用．准确性可达90％以上，灵敏度几乎达100％。②在体内可检出0．5cm大小病灶，并可检出肺、脑等部位转移灶。③小分子抗体轻易抵达肿瘤部位，可显著提升T(肿瘤组织)／NT(非肿瘤组织)值。④抗体在肿瘤部位，可保留6—9日。⑥能观察抗体在血中半衰期和出现不良反应。抗体制药专题知识专家讲座第55页（2）．放射免疫显像定位技术

是将抗肿瘤单克隆抗体(Ab)与二乙基三胺五乙酸(DTPA)在体外偶联，再注人体内，就能与肿瘤组织结合。因为抗体分子量较大，这一过程需3天才能完成。3天后注入半衰期短放射性核素In—113(半衰期100min)。因为原先注入DTPA是重金属离子络合剂，所以In—113就能够结合到DTPA分子上，从而使肿瘤组织显像。这一过程在2h之内即可完成。该技术含有简单、方便优点，可在导向诊疗中发挥更大作用。抗体制药专题知识专家讲座第56页

二、抗体治疗药品（体内用药品）抗体治疗药品研究已经有20多年历史，已制备出百余种单克隆抗体，判定出数十种与肿瘤相关抗原。但治疗用制剂尚没有一个到达商品化程度。在治疗药品中，单克隆抗体与毒素偶联物治疗淋巴瘤效果最正确，但有效率仅30%。当前客观现实是：研究进展快速，但未到达常规治疗应用阶段。障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能到达靶部位或摄取量低。鼠源性抗体排斥反应。

抗体制药专题知识专家讲座第57页(一)、放射性核素标识抗体治疗药品

抗体作为放射性核素导向载体，在人体内应用是比较成功。放射性核素标识抗体操作简便，放射性核素和抗体用量小，且能观察到药品在体内分布和药品动力学，故应用前景好。研究结果证实，1、放射性核素标识抗体有较大杀伤范围，这有利于克服肿瘤表面抗原异质性，对肿瘤细胞杀伤也不依赖抗原抗体结合后吸收作用。2、放射性核素标识抗体分子量小，更轻易穿透抵达肿瘤部位。所以，放射免疫治疗是导向治疗中活跃领域。其缺点是有些放射性核素起源困难，且需放射性保护和污物处理。抗体制药专题知识专家讲座第58页(二)、抗癌药品偶联抗体药品

1．惯用抗癌药品

主要有氨甲喋吟、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺、新抑癌蛋白和正定霉素等。以人血清白蛋白作为中间载体，可显著提升每分子抗体所携带药品量，使体外细胞毒性提升2倍，抗体药品偶联物对化学疗法耐药细胞株依然有效。抗体制药专题知识专家讲座第59页2．抗体类药品逆转耐药性

肿瘤细胞对药品可产生多药耐药性(MDR)。MDR是由基因调控，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关主要蛋白，有l280个氨基酸残基．相对分子质量为170一180kd跨膜蛋白。在细胞膜内折叠成6对，形成通道结构，胞浆侧有2个ATP结合区。当前认为P糖蛋白是ATP酶依赖性药泵，药品进入细胞后与P糖蛋白结合，利用ATP水解释放能量将药品泵出胞外，使胞内药品蓄积降低，因而产生耐药性。

肿瘤细胞多药耐药性(multidrugresistance)产生是造成肿瘤化疗失败主要原因之一。抗体制药专题知识专家讲座第60页针对肿瘤MDR产生过程，应用多药耐药逆转是处理肿瘤MDR主要伎俩。研究发觉大量含有MDR逆转活性化合物,主要包含：钙通道阻滞剂(维拉帕米及其衍生物)、钙调蛋白抑制剂(噻吩嗪类化合物)、免疫抑制剂(环孢菌素A及其衍生物)、类固醇和激素类似物(黄体酮、甲地孕酮）还有天然药品（中药）多药耐药逆转剂、反义寡核苷酸、

核酶、RNA干扰等。但多药耐药逆转剂毒副作用也使其临床应用受到限制抗体制药专题知识专家讲座第61页(三）毒素偶联抗体药品

(1)毒素起源当前主要起源是细菌毒素和植物毒素。惯用有以下几个：白喉毒素（DT)、绿脓杆菌外毒素(PE)、产气荚膜杆菌磷脂酶(PLC)、蓖麻毒素(RT)等。抗体制药专题知识专家讲座第62页(2)载体

载体主要作用是将毒素携带至靶细胞表面，并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。载体相对分子质量要小，识别与结合靶细胞能力强，特异性好。抗体制药专题知识专家讲座第63页CD4细胞是人体免疫系统中一个主要免疫细胞，在