液相色谱硬件基础知识-课件

第二局部硬件根底知识HPLC简易流程图输液泵进样器

色谱柱柱温箱检测器储液瓶数据处理系统脱气机储液瓶由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚四氟乙烯材料制成使用过程中储液瓶应适当密闭所有溶剂应先过滤，再装入储液瓶滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。

醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于DMF，THF，CHCl3等溶剂再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂前处理-过滤过滤：0.45μm或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，防止堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：1〕泵中气泡使液流波动，改变保存时间和峰面积2〕柱中气泡使流动相绕流，峰变形3〕检测器中的气泡产生基线波动

溶剂前处理-脱气常用脱气方法超声脱气减压脱气在线脱气脱气机-在线真空脱气脱气机主要由脱气管、真空室和真空泵组成。真空室内的脱气管由特殊的透析材料制成，当溶剂流经脱气管时，溶解在溶剂中的气体穿过管壁被脱出。到泵储液瓶脱气管真空室8输液泵性能要求能在高压下连续工作输出流量范围宽输出流量稳定、精确度、重复性高目的单元流速范围 特性和应用

LC-20AD0.0001-10ml/min极低脉动，适于半微量0.0001-5ml/min和LC-MS分析

LC-20AT0.001-10ml/min非凡的耐用性，适于常量分析

LC-20AB 0.0001-10ml/min极低脉动，适于半微量LC

和LC-MS分析分析

LC-15CLC-30A

岛津输液泵系列LC-20AT串联式柱塞往复泵选配件支架压力传感器泵头主进口单向阀泵头固定座LC-20AT辅助进口单向阀主泵头

副泵头单向阀LC-20AD并联式微体积柱塞往复泵选配件支架进口单向阀出口单向阀进液口泵头固定座泵头泵头泵头单向阀压力传感器LC-20ADLC-20AB压力传感器泵头泵头固定座进液口泵A连接块出口单向阀进口单向阀泵BLC-20AB柱塞往复泵结构示意图

单向阀结构抛光面球座宝石球单向阀工作原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头单向阀工作原理洗脱系统组成等度洗脱系统梯度洗脱系统｛梯度时间B%等度时间B%高压梯度洗脱系统低压梯度洗脱系统分析时间长别离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脱的原因当采用等度洗脱时：95%30%甲醇浓度在最短时间内获得最正确的别离使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时：梯度洗脱：优点：可提高别离度、缩短别离时间、降低最小检测量和提高别离精度本卷须知：溶剂的纯度要高，否那么梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器〔如紫外吸收检测器或荧光检测器〕，而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器〔如示差折光检测器〕查看空白实验的数据遵守分析周期。〔最初的分析数据不采用〕梯度洗脱要点输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂等度洗脱高压梯度系统数据处理系统泵泵泵ABC进样器分析柱柱温箱检测器混合器梯度准确率高需要2-3个泵

可以不配在线脱气机低压梯度系统一台泵最多可使用4种流动相泵前预混合需带在线脱气机低压梯度比例阀数据处理系统ABDC输液泵进样器分析柱柱温箱检测器脱气机混合器采用“HPLC〞级溶剂防止使用会引起柱效损失或保存特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择水的等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物波长(nm)纯化水去离子水吸光率HPLC用水可以通过以下几个方法得到：专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。去离子水重蒸；二次或三次重蒸水；

不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水水的等级未注入样品时空白梯度的色谱图水中不纯物的出峰水中的不纯物保存在柱中，随之被乙腈洗脱水的等级有机溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45μm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒〕优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱有机溶剂的等级甲醇乙腈正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图有机溶剂的等级确定最正确别离状态时的流动相pH选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液〔即使浓度稀也具有较强的缓冲能力〕确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收〔在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液〕选择缓冲液的步骤pK1pK2pK3醋酸4.87柠檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32常用代表性的弱酸的pKa值使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞：用纯水冲洗30-60min〔1ml/min〕，再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液的使用进样器手动进样器自动进样器要求：无残留扩散小进样体积可变可承受高压

手动进样器的原理图进样状态装填状态泵柱子泵柱子23165423165441654165进样体积

检测器响应值定量环体积的一半3倍定量环体积全量注入部分注入进样量和检测器响应的关系示意图局部注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20μl的定量环最多进样10μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，到达所要求的精密度及重现性。局部注入和全量注入交叉污染产生的原因

红色表示残留样品手动进样方法一般的方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态便捷的方法〔不需清洗〕1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态手动进样方法自动进样器由计算机自动控制定量阀，按预先编制注射样品的操作程序工作自动进样器清洗〔Rinse〕：进样针移动到清洗口，针的外壁被清洗液清洗的过程排气〔Purge〕：排除管路中的气泡和更换旧流动相的过程色谱柱常用色谱柱反相

C18(ODS)

、C8

、C4

、苯基、TMS、

氰基正相硅胶、氰基、氨基、二醇基离子交换色谱阳离子交换剂强阳离子交换剂(SCX)

R-SO3-弱阳离子交换剂(WCX)

R-COO-阴离子交换剂强阴离子交换剂(SAX)

NR4+弱阴离子交换剂(WAX)

DEAE体积排阻色谱苯乙烯－二乙烯基苯共聚物、葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺别离模式的选择反相色谱：第一选择反相离子对色谱/正相色谱：第二选择特殊：高分子量化合物：聚合物、

蛋白或糖类无机离子光学异构体103非极性高极性中等极性分子量

104105非水相水相正相反相离子交换离子对反相体积排阻色谱柱的选择β,β'氧二化学键合醚/三乙二醇/庚烷角鲨烷/水-甲醇化学键合十八碳聚烃/水-乙腈多孔硅胶硅胶薄膜氧化铝珠异构体分离及吸附色谱极性物（正相分配）非极性物（反向分配）不同类型化合物、同系物、分配色谱凝胶渗透色谱苯乙烯二乙烯汞聚凝胶分配色谱水/异辛烷/乙醇（含水固定相）不溶于水溶于水不溶于水溶于水凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱聚苯乙烯类、凝胶多孔玻璃多孔硅胶葡萄糖凝胶聚苯烯酰胺凝胶多孔玻璃分子量范围<2000>2000阴离子交换剂多孔性强碱强碱性薄膜阳离子交换剂多孔性强酸强酸性薄膜凝胶过滤色谱葡聚糖凝胶（小孔）离子交换色谱酸性物碱性物色谱柱的连接死体积可能会引起别离度变差和重现性变差等问题管线公螺母死体积好的连接差的连接色谱柱色谱柱的使用新色谱柱使用前：最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3mL/min)冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样处理新色谱柱先测柱效，并保存色谱图和实验条件。定期检测柱效色谱柱的使用1.流动相：高纯度，过滤pH范围有机溶剂与色谱柱匹配互溶、并能溶解样品2.净化样品3.使用保护柱：与色谱柱填料、内径一致防止色谱柱污染色谱柱的使用4.别离条件—流速、柱温、梯度的变化幅度5.定期使用强溶剂冲洗柱子。6.使用缓冲盐后，要先用含10%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。7.流动相正相反相转换时用异丙醇过渡色谱柱的存放存放前充分冲洗适宜的存放溶剂接好堵头，防止固定相干涸存放环境分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温箱柱温箱CTO-20A/AC空气强制循环式CTO-15C模块加热式CTO-30ACTO-10AS液相色谱检测器的选择样品的性质别离目的不同，对检测的要求不同定量：高选择性、高灵敏度定性或制备：通用性常用检测器紫外可见光检测器

(UV)二极管阵列检测器(PDA)荧光检测器(RF)示差折光检测器(RID)电导检测器(CDD)蒸发光散射检测器(ELSD)质谱检测器(LCMS)EinEoutA=eCl

=-log(Eout/Ein)lC:浓度

朗伯-比耳定律(A:吸光度)样品池紫外可见光检测器样品池参比池光电二极管EinEinEin光栅D2/W光源lEout紫外可见光检测器光电二极管紫外可见光检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量根底：朗伯-比耳定律，A＝eCL优点：1〕灵敏度高2〕对温度和流速不敏感3〕可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器双波长检测饮用水中4种农药残留双波长分析分析条件：色谱柱：Shim-packVP-ODS(150mmL.×4.6mmI.D.)流动相：Acetonitrile/50mMKH2PO4(pH3.0)=55/45(v/v%)流速：1.0mL/min柱温:40˚C检测:230nm,270nm进样:10µL日本饮用水标准〔2004年4月起实施〕1.磺草灵〔asulam〕2.甲基硫菌灵〔thiophanate-methyl〕3.环草隆1〔siduron〕4.环草隆2〔siduron〕5.依普同〔iprodione〕波长切换波长扫描启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定检查流通池与管路有无漏液检测时，请关闭前面板清洗流通池，防止堵塞标准流通池：12µL，耐压12MPa〔半微量流通池：2.5µL〕氘灯：2000小时，不要频繁的开关〔3小时〕紫外检测器二极管阵列检测器

样品池二极管阵列光栅D2/W灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器时间波长吸光度色谱光谱二极管阵列检测器二极管阵列检测器采集三维谱图，可以发现单波长检测时未检测到的峰光谱定性，谱库搜索峰纯度检验二极管阵列检测器启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定检查流通池与管路有无漏液检测时，请关闭前面板清洗流通池，防止堵塞标准流通池：10µL，耐压12MPa〔半微量流通池：2.5µL〕氘灯：2000小时，不要频繁的开关〔3小时〕二极管阵列检测器+hn1

hn2+*AA*hn1

hn2激发波长发射波长荧光*

荧光检测器

荧光检测器

氙灯样品池光电倍增管

光栅

荧光检测器原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：1〕灵敏度高，是最灵敏的检测器之一2〕选择性好3〕对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质或能经过衍生化反响产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、卟啉、儿茶酚氨等〔具有对称共轭体系〕或氨基酸、脂肪酸等需衍生后检测样品

荧光检测器启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定检查流通池与管路有无漏液检测时，请关闭前面板清洗流通池，防止堵塞温度上升，荧光强度下降〔常温附近温度变化超过1oC时，有些化合物强度变化到达5%〕标准流通池：12µL，耐压2MPa氙灯：2000小时〔RF-20AxL〕，不要频繁的开关荧光检测器荧光检测器应用氨基酸检测－OPA衍生CHOCHOo-phthalaldhyde(OPA)+R-NH2N-RAA脂肪酸检测－ADAM衍生CHN29-anthryldiazomethane(ADAM)+R-COOHCH2OCOR各组分浓度：0.02µmol/mL，进样10µL氨基酸检测－OPA柱后衍生光学系统示差折光检测器钨灯准直镜狭缝物镜狭缝反射镜样品池硅光电池调零透镜示差折光检测器示差折光检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器，缺点：1〕对温度变化敏感2〕对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3〕属于中等灵敏度的检测器示差折光检测器检测时，请关闭前面板清洗流通池，防止堵塞流通池：9µL，耐压2MPa

进口：63.5µL

出口：280.2µL

钨灯：20000小时示差折光检测器糖分析例分析条件色谱柱

:Shim-packCLC-NH2流动相

:乙腈

/水=7/3流速

:1.0mL/min温度

:室温峰1.甘油2.木糖3.果糖4.葡萄糖5.蔗糖6.甘露糖7.

乳糖

IV

LAAK(电导)

=I[A]/E[V]=A[cm2]/L[cm]xk

(k:电导率)

k=(I/E)x(L/A)电极电导检测器电极原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来测定电离物质含量，广泛应用于离子色谱法优点：对流动相流速和压力的改变不敏感缺点：对温度变化敏感〔温度每升高1℃，电导率增加2%-2.5%)用途：主要用于离子色谱，检测无机和有机离子电导检测器清洗流通池，防止堵塞流通池：0.25µL，耐压2.9MPa

电导检测器

分析条件色谱柱

:Shim-packIC-A3流动相

:8.0mMp-hydroxybenzoicacid

mMBis-Tris

流速:1.5mL/min温度:40℃进样体积

:100µL峰1.F-

(1.4ppm)2.Cl

-

(10200ppm)3.NO2-(10ppm)4.Br-

(43ppm)5.NO3-

(44ppm)6.SO4

2-

(431ppm)海水中阴离子分析例阳离子分析例分析条件色谱柱

:Shim-packIC-C1流动相

:5nM

硝酸溶液流速

:1.5mL/min温度

:40oC进样：50µL++++2+2+蒸发光散射检测器雾化蒸发检测流动相载气光源光电倍增管雾化器检测池光电倍增管LED漂移管原理:流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检验散射光的强度。优点:消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器缺点：不能使用非挥发性缓冲盐做流动相，如磷