噬菌体展示技术和其应用

噬菌体展示技术和其应用第1页/共68页2023/3/102Phagedisplay

噬菌体展示技术及其应用第2页/共68页2023/3/103

噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。

第3页/共68页2023/3/104非展示系统展示系统第4页/共68页2023/3/105TheexpressionofexogenouspeptidesonthesurfaceoffilamentousbacteriophagewasinitiallydescribedbySmithin1985.Sincehisfirststudy,differentmoleculessuchassmallpeptidesandantibodieshavebeendisplayedoncoatproteinsofphage,greatlyexpandingtheapplicationsofthetechnology.Thepastdecadehasseenconsiderableprogressinthetechniquesandapplicationsofphagelibraries.Inaddition,differentscreeningmethodshaveallowedisolationandcharacterizationofpeptidesbindingtoseveralmoleculesinvitro,inthecontextoflivingcells,inanimalsandinhumans.第5页/共68页2023/3/106-Invivouseofphagelibraries.Initiallythephagelibraryisinjectedinthecirculation.Next,phageisallowedtocirculateforminutesorhours(inthiscasewheninternalizedphagesaretoberecovered).Finally,afterdeepanesthesia,miceareeuthanizedandtheorgansaredissectedforphagerecoveryandpeptidesequencing.第6页/共68页2023/3/107Phagestructure.PIII,pVI,pVII,pVIIIandpXIXrepresent

phageproteins.Exogenouspeptidesareexpressedor“displayed”usually

onpIIIorpVIII.

第7页/共68页2023/3/108三丝状噬菌体的生物学形态：长杆状，长度约1um，管直径约6nm。基因组：约6400核苷酸大小的单链线状DNA，结构：●2700个主要蛋白（PVIII）分子螺旋状排列形成长管，●一头5个拷贝的次要壳蛋白PIII和PVI，●另一头则由次要壳蛋白PVII和PIX。生理：●F菌毛结合的序列是PIII蛋白N端的200个氨基酸。●一个分裂周期中可生产几百个子代，

●

其产量可达到0.3mg/ml。第8页/共68页2023/3/109外源蛋白的展示部位

第9页/共68页2023/3/1010噬菌体展示技术所展示外源多肽和及文库

1.

随机肽库

l

随机肽库通常较短（4~36氨基酸[8,9]长度）

l

编码它们的核酸由化学法合成而得l

其展示方式包括3，33，3+3，8，88，8+8等

2.

基因文库

l

基因组文库如DNAstaphylococcusaurous

l

cDNA文库

l

抗体库

l

病毒cDNA

3.各种自然蛋白及蛋白片段等

其中包括-半乳糖苷酶等蛋白片段；酶类如碱性磷酸酶，胰酶等；激素类如人生长素，血管紧张激素等；酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂等；毒素如蓖麻毒蛋白B链等；受体如IgE受体亚单位、T细胞受体等；触体如P物质、神经激肽A和B等；抗原及抗原表位；DNA和RNA结合蛋白如锌指蛋白等；酶底物如蛋白酶底物等；细胞素如IL3，IL6等。

第10页/共68页2023/3/1011抗体库技术简单流程第11页/共68页2023/3/1012

获得抗体基因第12页/共68页2023/3/1013

插入载体第13页/共68页2023/3/1014第14页/共68页2023/3/1015

表达第15页/共68页2023/3/1016

筛选第16页/共68页2023/3/1017第17页/共68页2023/3/1018噬菌体展示技术的发展简史1985年Smith—证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造[1]。1988年Parmley—将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢN端融合呈现在其表面[2]。1990年McCafferty—用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代[3]。一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。第18页/共68页2023/3/1019

噬菌体定义：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。

噬菌体宿主菌形态核酸T1-T7、λ、N4大肠埃希菌蝌蚪形dsDNA，线状P1志贺菌蝌蚪形dsDNA，线状P22沙门菌蝌蚪形dsDNA，线状SP01、SP82枯草芽胞杆菌蝌蚪形dsDNA，线状Φ29解淀粉芽胞杆菌蝌蚪形dsDNA，线状PM2假单胞菌微球形，有包膜dsDNA，线状ΦX174、S13、M12、G4大肠埃希菌微球形ssDNA，线状f1、fd、M13大肠埃希菌丝形ssDNA，线状MS2、f2、fr、Qβ大肠埃希菌微球形ssRNA，线状Φ6假单胞菌微球形，有包膜dsRNA，线状，分成3节段噬菌体分类：第19页/共68页2023/3/1020丝状噬菌体蝌蚪形噬菌体λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体第20页/共68页2023/3/1021T7与M13相比优势明显T7Select的优势解释是在细胞质中表达的裂解性噬菌体与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。C-端融合插入序列被克隆到T7Select载体基因10的C-端，可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。载体克隆容量大T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1kbp的片段都不稳定。插入片段稳定T7重组子很稳定，而M13重组子–

尤其是>1kb的很不稳定洗提条件灵活M13稳定性尚可，但是洗提条件颇受限制，SDS、盐、离液剂等，都能造成不稳定。而T7在1%SDS，5MNaCl，4M尿素，2M盐酸胍，10mMEDTA,100mMDTT，pH4-10等条件下稳定。生长迅速(小于3小时)，噬斑大明显缩短富集过程，每轮亲和淘洗之间时间少，2天内即可完成标准淘洗包装效率极高(>109pfu/ug)操作很简便，只需将DNA加到抽提物中，放置并铺板。克隆效率高M13要用电转化方能获得高效克隆，而T7Select制备大文库则容易得多第21页/共68页2023/3/1022噬菌体cDNA展示技术以改构的噬菌体为载体，cDNA基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面，通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体。第22页/共68页2023/3/1023噬菌体展示系统的类型产品概况载体用途展示拷贝数/噬菌体展示大小(氨基酸)宿主T7Select415-1多肽41540–50aaBL21T7Select1-1*蛋白或多肽≤11200aaBLT5403或5615T7Select1-2a,b&c蛋白或多肽≤1900aaBLT5403或5615T7Select10-3b*蛋白或多肽约为10>564**(上限待定)BLT5403或5615第23页/共68页2023/3/1024噬菌体cDNA展示技术的应用1用于模拟表位的研究。2用于DNA、RNA结合蛋白的研究。3用于蛋白-蛋白相互作用的研究。4用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。5细胞与蛋白相互作用的研究。6酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。第24页/共68页2023/3/1025第25页/共68页2023/3/1026问题1.没有一个系统能够表达所有的真核细胞蛋白。2.在外源cDNA插入噬菌体载体时存在双向插入，可能导致表达减少或者逆向表达。第26页/共68页2023/3/1027展望

噬菌体cDNA展示技术有效地实现了基因型和表现型的转换，在分子克隆的基础上，实现蛋白质构想的体外控制，从而可获得具有生物学活性的表达产物。若将其与蛋白质三维结构预测、分子模拟技术完美融合，对分子相互作用、分子识别、受体识别、酶学机制等研究进程将起到极大的推动作用。第27页/共68页2023/3/1028应用举例：部分做过的工作第28页/共68页2023/3/1029一、半合成噬菌体抗体库的构建

构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。

第29页/共68页2023/3/1030材料和方法人脐带血淋巴细胞

Ficoll–paqueplus购自Pharmacia公司。Trizol试剂购自Invitrogen

公司。pComb3噬菌体抗体表达载体：4029bp，含有可插入轻链和重链基因的克隆位点。大肠杆菌XLl-blue辅助病毒VCSM13

第30页/共68页2023/3/1031cDNA制备引物设计电转化感受态的制备辅助噬菌体的制备抗体库制备第31页/共68页2023/3/1032结果PCR扩增人抗体基因

图3.1λ链PCR扩增结果1-6泳道：VL1,VL2,VL3,VL4,VL5,VL6M：MarkerDL2,000图3.2κ链PCR扩增结果11-3泳道：VK1,VK2,VK3M：MarkerDL2,000第32页/共68页2023/3/1033图3.3重链分段PCR扩增结果1－3泳道：H135，H2，H4(约290bp)4－7泳道：CDR3-5,CDR3-8,CDR3-10,CDR3-12(约400bp)M：MarkerDL2,000

第33页/共68页2023/3/1034图3.4重链重叠PCR扩增结果1－3泳道：CDR3-5+(H135，H2，H4)融合结果4－6泳道：CDR3-8+(H135，H2，H4)融合结果7－9泳道：CDR3-10+(H135，H2，H4)融合结果10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4)融合结果123456M789101112M第34页/共68页2023/3/1035图3.5轻链和重链插入pComb3流程HL第35页/共68页2023/3/1036人源轻链抗体文库的构建

经限制性内切酶SacI和XbaI双酶切的人抗体轻链PCR产物与用相同内切酶酶切、去磷酸化的pComb3载体，16℃连接，用该连接产物进行电转化，根据1μl和10μl菌液铺平板所长出来的菌落数，可推算出人抗体轻链文库的库容量。

κ链文库的容量为5.03×106,λ链文库的容量为6.8×106(多次建库混合后的库容量)。从平板上随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养，菌落PCR鉴定。对于λ链文库，10个克隆中有6个阳性，λ链文库的插入率大约为60％；κ链文库10个克隆中有7个是阳性，其插入率大约为70％。

第36页/共68页2023/3/1037人源噬菌体Fab抗体半合成文库的构建

将酶切纯化的重链重叠PCR产物插入经酶切、并切胶回收纯化的轻链抗体文库中，转化感受态细胞，在辅助噬菌体VCSM13的超感染下，繁殖出表达人抗体Fab段的噬菌体，即为抗体组合文库。1μl和10μl转化菌铺平板计数，计算出κ＋Fd（包括CDR3-5到CDR3-12的全部随机化Fd片段）文库的库容为5.89×106。随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率为60％左右。第37页/共68页2023/3/1038

以相同的程序构建λ＋Fd链抗体库，库容量为6.55×106,随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中有5个克隆扩增出轻链和重链片段。双链插入率为50％左右。为了提高抗体库的库容量，在增加细菌转化效率的同时，进行了多次转化，每次转化都计算插入率。结果如表所示。第38页/共68页2023/3/1039表3.1抗体库的库容与抗体片段插入率

ND：未做第39页/共68页2023/3/1040混合抗体库的鉴定

将所构建的各种Fab抗体库混合成为最终的人源噬菌体抗体库，理论库容为1.97×107

实际的噬菌体抗体库滴度为3.9×1014cfu/ml。随机挑取10个菌落进行PCR，.电泳观察,双链阳性有5个(图3.6),单链（轻链或者重链）阳性有4个,空载体1个,Fab阳性率为50％左右。

第40页/共68页2023/3/1041图3.6半合成抗体库Fab重组克隆的PCR鉴定

其中1，2，4，5，8五个克隆为轻重链双阳性克隆M1L1H2L2H3L3H4L4H

M5L5H

6L6H

7L7H

8L8H第41页/共68页2023/3/1042讨论

本研究采取构建半合成抗体库的方法，以胎儿脐带血为材料，将基因组的VH段与人工合成的CDR3（共4组）拼接，在体外进行V-D-J重排，构建Fd段基因库，再与来自胎儿脐带血的轻链基因库组合。现已明确人类基因组中有约50个VH基因，分7个亚群，第6和第7个亚群仅各有一个基因。我们设计了三种VH基因5’端引物，其中可扩增出第1,3,5亚群，H2扩增第2亚群，H4扩增第4亚群，第6,7亚群因基因数量少未设计专门引物，但也可分别由H135和H4扩增。

第42页/共68页2023/3/1043

在进行CDR3随机化的过程中，进行重叠PCR时难免会有错误。故在完成Fd链的融合后，对Fd基因进行了检测，将产物克隆到T载体中，测定了5个克隆。发现有2个克隆在重叠区提前出现了终止密码子或者缺失D区，另外3个正常，分别属于VH1,VH2,VH4基因家族

第43页/共68页2023/3/1044为了增加抗体基因的丰度，在试验过程中提取淋巴细胞总RNA，可以避免提取

mRNA时容易降解和丢失目的基因。获得的抗体基因需要多次酶切、连接、转化等步骤，所以在这些过程中要尽量提高连接效率：可采取分步双酶切，保证切割完全，检测连接效率。

第44页/共68页2023/3/1045

实验过程中，克隆的抗体基因在细菌的培养过程中会有丢失现象发生，双链阳性率会由转化时的60％左右变成50％左右，与前人报告的情况一致。可能原因有：带有轻重链基因的克隆在细菌生长过程中发生缺失突变、带有抗体基因的克隆生长缓慢、辅助噬菌体CP-III蛋白与Fab－CPIII蛋白竞争进入噬菌体过程中部分噬菌体没有Fab－CPIII蛋白包装在表面。

第45页/共68页2023/3/1046二从噬菌体抗体库中筛选抗Tie2抗体

以Tie2为靶标，对已经建好的半合成噬菌体抗体库进行3轮的吸附、洗脱、扩增的筛选，获得2株能够同Tie2抗原特异性反应的Fab噬菌体抗体。第46页/共68页2023/3/1047材料与方法材料抗原Tie2-Fc，Ang1(购自A&BSystem公司)

对照抗原：BSA购自Sigma公司丙型肝炎病毒NS5—表面抗原(本室表达)IgG1标准品（Sigma公司）。抗体：HRP标记的抗VCSM13多克隆抗体（购自Sigma

公司）HRP标记的抗人IgGFab抗体（购自Sigma公司）

第47页/共68页2023/3/1048方法噬菌体滴度测定噬菌体抗体库的淘筛，制备噬菌体抗体的抗原结合活性-夹心ELISA试验噬菌体抗体的特异性鉴定－交叉反应性竞争抑制试验序列测定第48页/共68页2023/3/1049结果4.1半合成抗体库的筛选：将Tie2抗原过夜包被在酶连板中，对所得总库进行了三轮淘筛每轮洗脱噬菌体铺平板计数，分别是：2.8×104，

2.9×105，

2.6×106。经过三轮的吸附、洗脱、扩增的筛选，Tie2抗原对噬菌体抗体进行了特异性富集。从表4.1可以看出在三轮淘洗的过程中，噬菌体确实出现了特异性的富集，第三轮淘洗比第一轮的产率高出近40倍。

第49页/共68页2023/3/1050表4.1噬菌体抗体库的富集

第50页/共68页2023/3/10514.2噬菌体抗体的鉴定4.2.1噬菌体抗体的抗原结合活性－ELISA实验第三轮淘筛后，随机挑取60个克隆，制备单克隆噬菌体抗体，用间接ELISA法检测对Tie2抗原的结合活性。A490值超过0.8的有10个（见表4.2）。4.2.2

噬菌体抗体的交叉反应性鉴定和其他抗原的交叉反应性：将噬菌体抗体滴度较高的10个克隆同其他三种不同的抗原（HCVNS5蛋白，BSA，人IgG，）进行ELISA交叉反应，排除交叉反应抗体，剩余的抗体是特异性针对Tie2抗原的（表4.2）。第51页/共68页2023/3/1052表4.2筛选所得克隆与Tie2的结合活性及和其他抗原的交叉反应性第52页/共68页2023/3/10534.2.3竞争抑制试验结果：

为进一步验证所得噬菌体抗体对体Tie2抗原的特异性，用Ang1与阳性噬菌体抗体克隆做竞争抑制试验，结果表明：Ang1对部分噬菌体抗体的Tie2结合活性具有抑制作用。如表4.3所示

第53页/共68页2023/3/1054表4.3竞争抑制试验结果

第54页/共68页2023/3/10554.2.4所得克隆的酶切与测序：选取交叉反应小，有竞争抑制活性的克隆进行酶切鉴定(EcoRI＋XhoI酶切如图4.1所示)，片段大小为1.6Kb和3.7Kb大小正确。同时送部分菌株测序。

第55页/共68页2023/3/1056图

4.1pComb3-Fab酶切结果

3.7kb1.6kb

2000S1212S2S4M1M2S12,12,S2,S4Fab阳性克隆M1Λ/Ecot14M2DL2000第56页/共68页2023/3/1057序列分析

克隆S12测序结果与抗体胚系基因数据库（V-BASE）比较，重链属于VH4基因家族，与胚系基因DP-66同源性最高；D、J分别是D7-27和JH3a；轻链属于Vκ1家族，来自胚系基因DPκ3，J段属于Jκ2（如图4.2）。在重链的CDR3区，符合最初的（NNK）8的随机化设计，在CDR3前面共有人工加入的8个氨基酸，后面3个氨基酸是基本固定的。12号克隆重链属于VH1家族，与DP-23同源性最高，D、J分别是DP-26和JH4d，CDR3区，符合最初的（NNK）12随机化设计；轻链属于VL2家族，来自胚系基因DPL11，J段属于JL2/JL3a

。

在测序的克隆中，有两个克隆测序发现D基因缺失。

第57页/共68页2023/3/1058图4.2S12号克隆轻链重链可变区DNA及氨基酸序列

第58页/共68页2023/3/1059讨论

噬菌体抗体库展示技术的发展为不经免疫直接制备抗体成为可能；利用半合成抗体库直接获得人源抗体，是噬菌体展示技术中的主要方法之一。我们在本研究中从半合成抗体库中成功筛选出抗Tie2人源抗体Fab抗体，说明这一方法是可行的。但所得的Tie2抗体是否能在体内抑制Ang1配体的结合，还需进一步的试验。半合成抗体库的库容是一个重要参数，用组合感染法可以达到1010，常规的电穿孔法很难达到。我们的库容通过多次建库为1.97×107。在所建库中筛到的有些克隆VH基因不全，这和王琰的结论有相似的地方，在CDR3随机化的过程中，由于引物合成和重叠PCR的错误等原因，会产生一些不完整的基因。第59页/共68页2023/3/1060总结1从胎盘组织中克隆出Tie2膜外区基因