葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查 （药品生物检定技术课件）

实训五双黄连口服液微生物总数检查（一）实训目的1、掌握双黄连口服液中细菌和真菌总数的检查方法与操作。

2、学会供试品的处理方法及学会菌落计数方法。非规定灭菌药剂一般不要求绝对无菌，但必须控制微生物的数量在一定的范围内，并保证不含有特定的控制（致病）菌。2010年版《中国药典》规定采用平皿法和薄膜过滤法进行药品的细菌、真菌及酵母菌计数检查。本实验以葡萄糖酸钙口服液为材料进行平皿法计数。（二）实训原理（三）材料和用具1．器材、设备（1）设备：无菌室、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌器、菌落计数器、天平（感量0.1g）。（2）器材：橡皮乳头、酒精灯、乙醇棉球、乳胶手套、试管架、火柴、记号笔；无菌衣、裤、帽、口罩（也可用一次性物品替代）；研钵或匀浆仪、量筒、称量纸及不锈钢药匙；试管及塞子、刻度吸管（1、10ml）、锥形瓶、培养皿、玻璃或搪瓷消毒缸（带盖）。玻璃器皿均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽灭菌121℃20分钟，烘干备用。（三）材料和用具2．试剂及培养基（1）双黄连口服液为供试品。（2）消毒剂：0.2%苯扎溴铵溶液、75%乙醇溶液（制乙醇棉球用）、3%~5%甲酚溶液、5%甲醛、高锰酸钾等。（3）稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH6.8磷酸盐缓冲液（附录三）。（4）培养基：分别按照营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基配方（附录二）配制实验所需培养基，过滤、分装后灭菌。（四）操作步骤1．供试品溶液的制备取一定量（10ml）的待检药品，置于无菌研钵中以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（均需事先灭菌）研磨成匀浆，然后移入容量瓶内加缓冲液至100ml，即成1:10的供试液。2．供试液的稀释（10倍递增稀释法）取2~3支灭菌试管，分别加入9ml稀释液，并取1支1ml灭菌吸管吸取1:10均匀供试液1ml，加入已装有9ml灭菌稀释剂的试管中，混匀即成1:100的供试液。以此类推，稀释至1:1000或1:10000。3．注平板、倒培养基用灭菌移液管（每一稀释度用1支）分别吸取不同稀释度的稀释液1ml，置于每一无菌平皿中（每一稀释度做2~3个平皿），再于每一平皿中倾注15~20ml的温度不超过45℃的细菌、真菌或酵母菌计数用培养基（细菌计数用营养琼脂培养基；真菌及酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基），快速转动平皿使稀释液与培养基均匀混合，放置，待凝。（四）操作步骤4．阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，均匀混合，凝固。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。5．培养将已经凝固的平板倒置，营养琼脂培养基放30~35℃培养箱中培养3天，玫瑰红钠琼脂培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基放入23~28℃培养箱中培养5天。6．菌落计数除另有规定外，细菌培养3天，真菌、酵母菌培养5天，逐日点计菌落数，必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有真菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计真菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的真菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基中的真菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。（四）操作步骤7．菌数报告细菌、酵母菌选取平均菌落数小于300cfu，真菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。（五）实训报告检品名称生产厂家检品规格生产批号检品数量包装和外观检验项目微生物总数检验依据2010年版《中国药典》部附录检验方法平皿法检验结果细菌数（营养琼脂培养基，30~35℃培养3天）真菌、酵母菌数（玫瑰红钠琼脂培养基，23~28℃培养5天）10-110-210-3阴性对照10-110-210-3阴性对照123平均值结果检验结论检验人：复核人：室温：湿度：检验日期：1．供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。2．倾注和摇动应尽量平稳，勿使培养基外溢，确保细菌分散均匀。3．倾注时培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。4．管尖不接触任何可能污染的容器或用具。5．稀释时每一级换管（原吸管不要吹吸）的上一级吸管不能接触下一级稀释液。6．吸管快速吹打，不能用