AmpC酶的研究进展

AmpC酶的研究进展第1页/共54页研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防

第2页/共54页TheprevalenceofInfectiousDiseases第3页/共54页第4页/共54页

开发一种新抗生素需要10年需花费5-10亿美元一代耐药菌的产生只要2年时间后抗生素时代已经来临？！携带NDM-1的超级大肠埃希菌第5页/共54页细菌耐药的主要机制灭活酶产生孔蛋白改变主动外排其他机制…靶点改变第6页/共54页灭活酶种类-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶:

磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶氯霉素乙酰转移酶其它：磷霉素、红霉素乙酰化酶林可霉素、克林霉素乙酰化酶等第7页/共54页-内酰胺酶：最主要的灭活酶目前已发现300多种新的种类不断出现对-内酰胺抗生素造成严重威胁第8页/共54页临床关注的重要-内酰胺酶超广谱-内酰胺酶(ESBLs)高产头孢菌素酶(AmpC酶)碳青霉烯类酶(AmblerB类金属酶;AmblerA,D类-内酰胺酶)第9页/共54页1研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防第10页/共54页AmpC酶的定义是由革兰阴性细菌(肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌等)的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶，属Bush分类（底物谱分类法）Group1，Ambler分类（分子结构分类法）ClassC首选作用底物是头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制,

因此在国内又称作头孢菌素酶。因可被某些β内酰胺类抗生素诱导产生,又称诱导酶。第11页/共54页AmpC酶生化特性相对分子量(Mr)介于38-42KDa。灭活β-内酰胺酶抑制剂，如对克拉维酸等不敏感.正在研究开发的硼酸类抑制剂BRL42715、

RO48-1265、RO48-1220对其有较强的抑制作用。第12页/共54页AmpC酶生化特性对青霉素类抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青霉素（替莫西林）外均耐药。对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药。对头霉素类耐药。对第四代头孢菌素一般表现为敏感。对碳青霉烯类抗生素敏感。但细菌高产AmpC酶结合外膜孔蛋白缺失可导致对其耐药。第13页/共54页产ESBL与AmpC的耐药谱差别ESBLAmpC

耐药谱 多重 多重对三代头孢 多耐药 耐药头孢吡肟 多敏感 敏感哌酮/舒巴坦 大多敏感 耐药哌拉/他唑巴坦 大多敏感 耐药头霉素 大多敏感 耐药碳青霉烯类 敏感 敏感第14页/共54页产AmpC酶细菌感染的患者死亡率显著升高32%15%P=0.03死亡率%非耐药菌产AmpC酶耐药菌产AmpC酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的2倍第15页/共54页1研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防第16页/共54页AmpC酶的基因构成由5个不连锁基因即ampC、ampR、ampD、ampE

和ampG组成ampC是AmpC酶的结构基因，编码产生AmpC酶蛋白基因ampR、ampD、ampE、ampG是AmpC酶的调节基因，参与调控AmpC酶的合成过程。第17页/共54页AmpC酶的基因构成ampR是AmpC的转录调节因子，属于LysR调节子家族。AmpR在非诱导状态下作为ampC转录的抑制因子，而在诱导状态下作为转录激活因子存在。ampD是AmpC表达的负调控基因，位于远处染色体上，参与肽聚糖代谢。ampD的基因序列与AmpC酶的表现型密切相关。第18页/共54页AmpC酶的基因构成AmpE蛋白充当一个感受器，协助ampD完成对ampC的阻遏作用，在整个调节系统中居次要地位。ampG编码转膜蛋白AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚糖量的变化，在AmpC酶的表达中起着向胞浆内传递诱导信号的作用。第19页/共54页染色体AmpC酶表达类型（1）诱导高产型:低基础水平和高诱导产生（2）持续高产型:高基础水平持续表达，亦称：稳定的去阻遏表达型（3）持续低产型:低基础水平持续表达第20页/共54页（1）诱导高产型

当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在100～1000倍之间。第21页/共54页（2）持续高产型

原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生有缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR调控蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。第22页/共54页（3)持续低产型

部分产AmpC酶的菌株持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是缺乏ampR基因或ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无β内酰胺类存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平表达。第23页/共54页1

研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防第24页/共54页AmpC的发展简史20世纪90年代前，为染色体型。90年代后发现质粒型，呈持续高表达,并在同种和不同种细菌间水平播散，造成更严重的耐药性。质粒型AmpC种类在不断增加，目前已达50余种。产质粒型AmpC酶细菌：没有或具有不健全AmpC染色体的细菌种属→具有健全AmpC染色体的细菌。第25页/共54页质粒AmpC酶流行背景1989年Bauenfeind等报道了质粒AmpC酶CMY-1，但没有提供其生化特征。第一个公认的质粒AmpC酶是1988年在美国普罗维登斯一家医院由Papanicolaou等从肺炎克雷伯菌中发现的MIR-1。从此以每年发现1～3个新质粒的速度增加。第26页/共54页第27页/共54页第28页/共54页质粒AmpC酶的世界流行状况非洲ACC-1，CMY-4亚洲MOX-1，DHA-1，ACT-1,FOX-2，CMY-I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26欧洲BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2，FOX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1美洲MIR-1，ACT-I，FOX-1/2/5/6/8/10，CMY-2/3/4/5/19/20/23/24/25第29页/共54页我国pAmpC酶的检测状况北京协和医院ACT-1，CMY-2首都医科大学DHA-1，CMY-2中山医科大学DHA-1,ACT-1,CMY-2浙江医科大学DHA-1，CMY-2/4/11上海市传染病医院安徽医科大学DHA-I，CMY-2DHA-1，ACT-1/2，CMY-2，MOX-4，ACT-6第30页/共54页pAmpC酶的来源系统进化树研究表明：pAmpC酶和某些菌属的染色体AmpC酶有着高度的同源关系。根据和不同菌属的染色体AmpC酶的同源关系，pAmpC酶可分为以下5组：第31页/共54页pAmpC酶的分类弗氏枸橼酸杆菌组LAT-1/2/3/4、CMY-2/3/4/5/6/7/9、BIL-1阴沟肠杆菌群组MIR-1、ACT-1气单胞菌属组MOX-1/2、FOX-1/2/3/4/5/6、CMY-1/8/11摩根摩根菌组DHA-1/2蜂房哈夫尼菌组ACC-1第32页/共54页pAmpC酶的来源途径推测推测质粒介导的AmpC酶基因是来源于染色体的，目前大量的线索表明可能是通过整合子实现的。整合子(Integron)是近来新发现的能将耐药基因传递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因，是细菌遗传进化天然克隆和表达系统。第33页/共54页1

研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防第34页/共54页

AmpC酶的检测方法表型检测基因检测pAmpC酶确认需分两步:(1)明确是否为高产AmpC酶

(2)是否为质粒介导:通过质粒接合实验、Southern杂交证实第35页/共54页

AmpC酶的检测方法

表型检测方法:

头孢西丁敏感实验头孢西丁三维试验

第36页/共54页头孢西丁敏感试验操作：按CLSI标准操作判断：K-B法<18mm，稀释法>16μg/ml为耐药意义：耐FOX的菌株有可能产生AmpC酶缺点：特异性差第37页/共54页头孢西丁三维试验

将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平板上，取30μg头孢西丁纸片置于平皿中心，用刀片在离纸片边缘5mm处放射状地由里向外切割一道狭缝，取40微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将MH平板放入35℃孵箱过夜。第38页/共54页头孢西丁三维试验

结果判断：出现ATCC25922箭头样生长，为三维试验阳性。

是目前公认的检测高产AmpC酶的经典方法。第39页/共54页AmpC酶的检测方法

基因检测法:1聚合酶链反应(PCR)2核酸杂交(Southernblot)3核苷酸序列分析法:是诊断最可靠和发现新酶的方法

第40页/共54页AmpC酶的检测方法

方法虽多，但至目前CLSI仍未制定临床筛选AmpC酶的标准，随着产AmpC酶的革兰阴性杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视，需要建立一种快速、简便的方法常规筛选AmpC酶，任务任重而道远。第41页/共54页1研究AmpC酶的科学意义2AmpC酶的生化特性3AmpC酶的基因与表达4AmpC酶的发展简史5AmpC酶的检测6产AmpC酶菌的治疗与预防第42页/共54页药物治疗给予抗菌治疗后因为敏感菌株的相继死亡，突变菌株被选择出来耐药的克隆在过去曾是敏感的菌落中生长在治疗过程中耐药成为临床表现敏感菌落中存在着自发的突变菌株耐药是选择出来的第43页/共54页不宜使用第三代头孢

三代头孢菌素是AmpC酶的弱诱导剂，但诱导产生的低水平的AmpC酶不足以导致对三代头孢菌素的耐药，而在AmpC基因阳性菌株中使用三代头孢菌素，可能会筛选出高产AmpC酶的耐药株，导致耐药菌流行。因此:

合理使用三代头孢菌素是减少高产AmpC酶突变株引发耐药的关键。第44页/共54页

不应用β-内酰胺酶复合制剂克拉维酸不抑制AmpC酶，反而为强诱导剂;舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果也非常有限；故β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂不应用于治疗高产AmpC酶耐药株感染。第45页/共54页第四代头孢菌素

对AmpC酶亲和力较低（较高的Km值）能快速地通过细菌的外膜屏障与PBP结合

头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素。第46页/共54页碳青霉烯类抗生素

亚胺培南，美罗培南等。尽管它们是AmpC酶的强诱导剂，但它们对AmpC酶高度稳定，能在诱导产生足量的AmpC酶之前快速地杀死细菌。同时亦能用于治疗产ESBL肠杆菌属细菌引起的医院感染。

降阶梯治疗-严重细菌感染新策略第47页/共54页第四代头孢菌素有明显的抗菌活性；碳青霉烯类疗效最好（尤其合并ESBLs时）；可根据