中药淡豆豉异黄酮类化合物的超声循环提取

兰州文理学院学生论文题目：中药淡豆豉异黄酮类化合物的超声循环提取作者：李培东化工学院系应用化学专业2013级年制2班2016年5月20日中药淡豆豉异黄酮类化合物的超声循环提取摘要：在超声循环条件下，探讨从中药淡豆豉中提取总异黄酮的工艺。以淡豆豉中总异黄酮提取率为评价指标，考察了不同固液比、提取温度、乙醇体积分数、超声时间、超声次数、超声功率对总异黄酮提取率的影响。通过单因素实验和正交实验L（34）确定的最佳工艺条件为：提取温度50e,乙醇体积分数为60%,超声功率800W,超声时间90（30,30，30）min。按最佳工艺扩试3次，淡豆豉中总异黄酮平均提取率达1.6966%,相对标准偏差（RSD）为2.0%（n=3）。关键词：淡豆豉；大豆素；异黄酮；超声循环提取；中药现代化技术淡豆豉（SemenSojaepraeparatum）由豆科植物大豆的成熟种子和青蒿、桑叶等经发酵加工而成，为常用中药，历版5中国药典6均有记载。它具有解表除烦、宣发郁热等功效，常用于感冒、头痛、胸闷、虚烦不眠等症，具有抗骨质疏松、保护血管、降血糖、降血脂、抗更年期综合症等多方面的作用［1］。淡豆豉中异黄酮类物质为活性成分［2］，为对药材进行合理的开发利用，需要寻找一种提取淡豆豉总异黄酮的经济、高效方法。中药现代化重要内容之一就是中药提取过程的现代化。传统的水提法耗时、耗能、提取产率低。现代利用外场、外力强化和辅助提取，如微波法［3］、超声波法、超临界流体萃取法等［4］，是提高提取速度和效率的需要。超声循环提取技术中，超声波强化了溶出成分从细胞内向细胞外的扩散；循环技术使药用成分在提取介质中快速达到浓度平衡，可大大缩短提取时间，提高产品质量；该技术是当前浸出提取中最具前途的提取技术。目前，关于淡豆豉中异黄酮类化合物提取工艺的研究较少，窦玉红等［3］曾以染料木素含量为指标，对淡豆豉进行了热回流提取研究。本研究以大豆素（daidzein）为对照品，用超声循环技术对淡豆豉中异黄酮类化合物进行提取，确定了影响提取效果的主要因素和超声提取异黄酮的优化工艺条件，旨在寻找快速、高效提取淡豆豉中总异黄酮的方法［5,6］。实验部分1.1仪器与原料A2紫外分光光度仪（美国PE公司）；SY-1000超声循环提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司）;旋转蒸发仪RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平BS223S（德国Sartorius公司）。淡豆豉购自石家庄乐仁堂药店，经河北医科大学药学院生药教研室赵丁教授鉴定粉碎，过80目筛。大豆素（Sigma公司），其他试剂均为AR。1.2总异黄酮含量的测定测定波长的选择：用C（NaOH）=0.01mol/L的水溶液溶解淡豆豉提取物和大豆素对照品，并用空白试剂做参比，进行定性实验，发现二者在K=259.0nm处均有最大吸收峰。因此，选择259.0nm为测定波长。标准曲线的制作：精密称取真空干燥24h的大豆素对照品5.8mg，用C（NaOH）=0.01mol/L的水溶液溶解，容量瓶中定容至100mL，摇匀。分别取0.50、0.80、1.10、1.40、1.70mL置10mL容量瓶中，加C（NaOH）=0.01mol/L的水溶液定容至刻度。用空白试剂做参比，在259.0nm测定相应的吸光度。以吸光度为横坐标，大豆素的质量浓度（yg/L）为纵坐标，进行回归分析，得到标准曲线方程：p=15.246A-0.1576（R=0.9996）。总异黄酮含量测定：取符合实验要求的淡豆豉，精密称取50go加正己烷200mL超声振荡脱脂25min,弃去正己烷，重复一次。按标准曲线，用空白试剂做参比，在259.0nm测定相应的吸光度。带入大豆素标准曲线方程得出质量浓度，并计算提取率。正交实验单因素选择根据淡豆豉及异黄酮类化合物的理化性质，进行单因素分析。考察不同固液比、乙醇体积分数、超声时间、超声次数、提取温度对淡豆豉总异黄酮提取率的影响，优选最佳单因素水平。正交实验优选最佳提取工艺选取提取温度（A）、乙醇体积分数（B）、超声功率（C）、超声时间（D）为主要考察因素，各因素及水平设置见表1。用L9（34）正交表进行正交实验。表1因素水平表LevelA/°CB/%C/WD/min1305040030(10,10,10)2406060060(20,20,20)3507080090(30,30,30)1.5方法学考察（1） 重复性实验：取5份供试品溶液0.10mL，按标准曲线，用空白试剂做参比，在259.0nm测定相应的吸光度。RSD=0.19%。（2） 稳定性实验：取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0、15、30、60、120、240min，测定对照品溶液及供试品溶液吸光度，其RSD分别为0.9%、1.2%。表明对照品溶液及供试品溶液在4h内稳定。（3） 回收率实验：精密吸取标准品溶液25、50、25、50、25yL，分别置5只5mL容量瓶中，再分别精密加入供试液150yL，用C（NaOH）=0.01mol/L的水溶液定容至刻度，摇匀，测定吸光度，计算回收率，结果平均回收率为98.7%，RSD=1.8%。结果与讨论2.1单因素分析（1） 固液比：以屮（C2H5OH）=60%的乙醇为提取剂，与相应质量的淡豆豉分别按m（淡豆豉）m（乙醇）=1:100；2:100；4:100；7:100；10:100的固液质量比混合，在400W，1000r/min，室温进行超声循环提取20min，测定供试品溶液吸光度，并计算结果。总异黄酮提取率依次为1.4193%、1.4177%、1.4127%、1.4088%、1.4028%。可以看出，m（淡豆豉）m（乙醇）=1:100时提取效率最高，但与其他固液质量比比较相差不大，综合考虑到成本及后续溶剂回收量大小，以下的单因素分析及正交实验均采用m（淡豆豉）m（乙醇）=1:10。（2） 提取温度：取淡豆豉50g，屮（C2H5OH）=60%的乙醇为提取剂，在400W,1000r/min,于不同温度（20、30、40、50、60、70e）进行超声循环提取，测定供试品溶液吸光度，计算总异黄酮质量分数依次为1.0504%、1.1441%、1.2140%、1.1189%、1.0716%、1.0338%。可以看出，40e总异黄酮提取效率最高，因此，选取30、40、50e进行正交实验。（3） 乙醇体积分数：取淡豆豉50g，用体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇为提取剂，在400W，1000r/min,室温进行超声循环提取20min,测定供试品溶液吸光度，计算总异黄酮提取率依次为1.0384%、1.0620%、1.1549%、1.2380%、1.2899%、1.3778%、1.2642%、1.2120%、0.9555%。可以看出，用屮（C2H5OH）=60%的乙醇提取，总异黄酮提取率较高，因此，选择屮（C2H5OH）=60%左右的乙醇进行正交实验。（4） 超声时间：取淡豆豉50g，屮（C2H5OH）=60%的乙醇为提取剂，在400W，1000r/min,室温下于不同时间（10、15、20、25、30、35、40、45、50min）进行超声循环提取，测定供试品溶液吸光度，计算总异黄酮提取率依次为0.7380%、0.8505%、1.1027%、1.0571%、0.9908%、0.7456%、0.6685%、0.6503%、0.6493%。可以看出，随着时间的增加，总异黄酮提取率先增加后减少，在20min时提取率最高，因此，选择20min左右进行正交实验。（5） 超声次数：取淡豆豉50g,v（C2H5OH）=60%的乙醇为提取剂，在400W,1000r/min,室温进行超声循环提取，提取次数分别为1、2、3、4次时，测定供试品溶液吸光度，计算总异黄酮提取率依次为1.0364%、1.1004%、1.1881%、1.1892%。可以看出，随着提取次数的增加，异总黄酮质量分数也随着增加，但3次后总异黄酮质量分数增加缓慢，因此，提取3次即可。2.2正交实验设计及结果分析正交实验采用四因素三水平正交表，且在正交表安排的每个实验号条件下进行3次重复实验，见表2。采用极差法对正交实验结果进行差异分析，见表3。

表2正交实验结果NoABCDIsoflavones/%123Add111111.04640.94181.15113.1393212221.29151.17421.05683.5225313330.98401.20271.09333.2800421231.36081.32711.11343.7113522311.02451.25211.13833.4149623120.82390.74150.90632.4717731321.51381.23861.37624.1286832131.21651.35171.48694.0551933211.15781.27361.04053.4734表3正交实验方差分析SVSSDFMSF PA0.900720.450417.46 <0.01B0.830020.415016.08<0.01C0.520420.260210.08<0.01D0.459520.22988.91 <0.01E(Error)0.4646180.0258:SV方差来源；SS平方和；DF自由度；MS-平均平方和；F0.01(2,=).0l。结果表明，淡豆豉中总异黄酮的最佳提取条件为A3B2C3D3,即提取温度50°C,乙醇体积分数60%，超声功率800W,超声时间90(30,30,30)min。4种因素对淡豆豉中总异黄酮提取效果的影响程度依次为：乙醇体积分数＞提取温度＞超声功率＞超声时间。F检验结果表明，提取温度、乙醇体积分数、超声时间、超声功率对总异黄酮提取率都有显著的影响。2.3最佳工艺验证实验为考察上述优选工艺条件的稳定性，取淡豆豉100g,在最佳提取条件下进行3次重复实验,总异黄酮的提取率见表4。3次实验结果均优于正交实验表中任何一组,平均提取率为1.6966%,RSD=2.0%(n=3),说明该工艺稳定可靠。且总异黄酮提取率高于热回流提取法。表4验证实验实验次数平均值12 3总异黄酮收率/% 1.71861.6914 1.67981.6966结论超临界CO2萃取技术是提取三七中三七总皂苷的高效方法，具有提取率高、周期短、无污染、提取物色泽及品质好等优点。三七经轧胚后，微观组织结构被破坏，利于三七中生物活性物质的提取。改进了三七总皂苷中人参皂苷Rb1的定量分析方法,V(乙腈)V(水)=30:70,柱温45°C，三七总皂苷中的人参皂苷Rb]得到更好分离⑹。在单因素实验的基础上，采用正交实验，对三七总皂苷萃取工艺条件进行了优化，优化的粉碎工艺萃取条件为：萃取温度45C,压力38MPa,CO2流量23kg/h,萃取时间3.0h,夹带剂300mL,提取率7.97%；优化的轧胚工艺萃取条件为：萃取温度45C，压力35MPa,CO2流量20kg/h，萃取时间2.5h，夹带剂350mL,提取率9.98%。轧胚工艺比粉碎工艺提取率高2.01%。参考文献：文刚，刘育辰,鲍建才，等.三七药理作用的研究进展[J].人参研究,2005，⑶:12-17.蔡广,曾知恒.三七总苷制剂治疗心血管病研究进展[J].人民军