中药川芎有效成分鉴别的实验材料

对于川芎的认识一、补阳还五汤由黄芪，当归，赤芍，地龙，川芎，红花，桃仁六味药材组成。本次试验主要研究黄芪，当归，川芎的有效成分。二、实验分为两部分：川芎中有效成分的提取与分离纯化，以及运用薄层色谱技术对中药中有效成分的鉴别。三、川芎含挥发油约1％。鉴定出油中成分有40种，占挥发油的93.64％，其中主成分为藁本内酯(ligustilide)占58%、3-丁酜内酯(3-butylphthalide)5.29%和香桧烯(sabinene)6.08%。根茎中所含的内酯化合物，除上述提到的二种外，尚含丁烯酜内酯(butylidenephthalide)、川芎内酯(sankyunolide)、新蛇床内酯(neocnidilide)、4-羟基-3-丁酜内酯(4-hydroxy-3-butylphthalide)、川芎酚(chuanxingol)、双藁本内酯(2,2'-diligustilide),以及3-丁基-3,6,7.三羟基-4,5,6,7-四氢苯酞等。含氮化合物有四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,川芎嗪，chuanxiongzine)、perlolyrine、盐酸三甲胺、盐酸胆碱、L-异亮氨酰-L-缬氨酸酐(L-isobutyl-L-valineanhydride)、L-缬氨酰-L-缬氨酸酐、1-乙酰基-卩-卡啉、尿嘧啶、腺嘌岭和腺苷。酸性或酚性化合物有4-羟基-3-甲氧基苯乙烯、1-羟基-1-(3-甲氧基4-羟基苯)-乙烷、4-羟基苯甲酸、咖啡酸、香荚兰酸、阿魏酸(ferulicacid)、瑟丹酸(sadanicacid)、大黄酸(chrysophicacid)、棕榈酸、香荚兰醛和亚油酸。此外,川芎根茎尚含中性油,其成分为十五、十六、十七、十八烷酸乙酯，异十七、异十八烷酸乙酯和异十七烷酸甲酯。另含5,5'-联咲哺甲酰醚(bis-5,5'-formylfurfurylether)、匙叶桉油烯醇(spathulenol)、卩谷甾醇、蔗糖和一种脂肪酸甘油酯。含氮化合物中的川芎嗪是川芎根、茎中提取的一种活性生物碱——四甲基吡嗪,为川芎中最主要有效成分之一,约占生药含量的0.1%〜0.2%,川芎嗪主要有盐酸川芎嗪(TMPH、和磷酸川芎嗪(TMPP、两种形式。数种内酯类化学成分，其中川芎内酯A(4,5-二氢-3-丁烯基苯肽)B约占川芎生药的1.6%,是川芎的主要成分。川芎的活性成分有以藁本内酯、川芎内酯为主的苯酞类,以川芎嗪为代表的含氮化合物类和以阿魏酸为代表的有机酸类。常用的中药有效成分提取方法从药材中提取活性成分的方法有溶剂法、水蒸气蒸馏法及升华法等。一般用溶剂法提取中药材的有效成分,常用的方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等。浸渍法：是在常温或温热(60〜80°C)条件下用适当的溶剂浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法适用于有效成分遇热不稳定的或含大量淀粉、树胶、果胶、黏液质中药的提取。渗漉法：是不断向粉碎的中药材中添加新鲜浸出溶剂,使其渗过药材,从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种方法。煎煮法：是在中药材中加入水后加热煮沸,将有效成分提取出来的方法。此法简便,但含挥发性成分或有效成分遇热易分解的中药材不宜用此法。回流提取法：是用易挥发的有机溶剂加热回流提取中药成分的方法。但对热不稳定的成分不宜用此法。连续回流提取法：弥补了回流提取法中溶剂消耗量大，操作繁杂的不足，实验室常用索氏提取器来完成本法操作。但此法时间较长。水蒸气蒸馏法：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，且难溶或不溶于水的成分的提取。升华法：固体物质在受热时不经过熔融直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体的现象叫做升华。中药中有一些成分具有升华的性质，能利用升华法直接从中药中提取出来。将提取法归类，由溶剂提取法和非溶剂提取法。中药有效成分的分离常用分离方法：溶剂法、沉淀法、结晶法、色谱分离法（一）溶剂法1.酸碱溶剂法：混合物中各组分的酸碱性不同进行分离（1）酸溶：有机碱性成分可与无机酸成盐而溶于水。（2）碱溶：具有羧基，用碳酸氢钠；具有酚羟基，用氢氧化钠；具有内酯或内酰胺结构的成分可被皂化而溶于水。使用注意：酸碱的强度、加热温度、与被分离成分接触的时间等。溶剂分配法。原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。一般采用少量多次分配医.学教育网搜集整理提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。1）系统溶剂萃取法：常用于中药化学成分的初步分离漏斗2）连续液-液萃取装置3）液滴逆流层析法（二）沉淀法原理：基于有些中药化学成分能与某些试剂生成沉淀，或加入某些试剂后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一种方法。专属试剂沉淀法：例如：雷氏铵盐沉淀季铵碱、胆甾醇沉淀甾体皂苷；明胶沉淀鞣质。分级沉淀法：改变加入溶剂的极性或数量使沉淀逐步析出的方法。多糖、蛋白质等。盐析法：在混合物水溶液中加入易溶于水的无机盐，最常用的是氯化钠，至一定浓度或饱和状态，使某些中药成分在水中溶解度降低而析出，或用有机溶剂萃取出来。（三）结晶法1.原理：利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同达到分离的方法，是纯化物质最后阶段常采用的方法，其目的在于进一步分离纯化目标化合物。2.溶剂选择：被溶解成分的溶解度随温度不同应有显著差别；与被结晶的成分不应产生化学反应；沸点适中等。常用于结晶的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸、吡啶等。当用单一溶剂不能达到结晶时，可用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂进行结晶操作。（四）色谱分离法1.吸附色谱原理：利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异，而实现分离的一类色谱。常用的吸附剂包括硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺等。（1）硅胶：吸附作用是由于颗粒表面有很多硅醇基，它可以和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，极性大小分离，广泛，大多数成分的分离，微酸性、不宜分离碱性物质。用硅胶加粘合剂处理方法如下：薄层类别吸附剂（g）：用水量（ml）活化硅胶G1:2或1:380°C或105°C1/2〜1小时硅胶CMC-Na1:3（0.5%〜1.0%CMC-Na水溶液）80°C20~30分钟或阴干硅胶CMC-Na1:3（0.2%CMC-Na水溶液）80C20~30分钟或阴干氧化铝G1:2或1:2.5110C30分钟氧化铝-硅胶G（1:2）1:2.5或1:380C30分钟硅胶-淀粉1:2105C30分钟硅藻土G1:2110C30分钟（2）氧化铝：微碱性、适宜分离碱性物质。（3）聚酰胺：适于分离黄酮、酚、醌类、有机酸及鞣质。2.凝胶过滤色谱（排阻色谱、分子筛色谱）原理：主要是分子筛作用，根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小而达到分离目的。当混合物溶液通过凝胶柱时，比凝胶孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比凝胶孔隙不能进入凝胶内部，只能通过凝胶颗粒间隙，首先被洗出。常用的是葡聚糖凝胶（sephadexG）和羟丙基葡聚糖凝胶（sephadexLH-20）。3.离子交换色谱原理：基于各成分解离度的不同而分离。离子交换剂的种类：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶。应用：主要用于生物碱、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等水溶性成分的分离纯化大孔树脂色谱原理：大孔树脂是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子物质。它可以通过物理吸附有选择地吸附有机物质而达到分离的目的。色谱行为：反相的性质，一般被分离物质极性越大，越先被洗脱下来，极性越小，越后洗脱下来。对洗脱剂而言，极性大的溶剂洗脱能力弱，而极性小的溶剂则洗脱能力强，故大孔树脂在水中的吸附性强。大孔吸附树脂色谱被引进应用于中药有效部位或有效成分的分离富集。它具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等特点。分类：根据骨架材料是否带功能基团，大孔吸附树脂可分为非极性、中等极性与极性三类。分配色谱（1） 基本原理利用物质在固定相和流动相之间分配系数不同而达到分离。（2） 分类正相色谱：固定相极性＞流动相极性，用于分离极性和中等极性的成分。常用固定相：氰基或氨基键合相；常用流动相为有机溶剂。反相色谱：固定相极性＜流动相极性，用于离非极性和中等极性的成分，常用C18或C8键合相。常用流动相为甲醇-水或乙腈-水。薄层色谱吸附薄层色谱法（1）吸附剂：常用的吸附剂有硅胶和氧化铝，最常用的是氧化铝。硅胶本身显弱酸性，直接用于分离和检识生物碱时，与碱性强的生物碱可形成盐而使斑点的Rf值很小，或出现拖尾，或形成复斑，影响检识效果。为了避免出现这种情况，在涂铺硅胶薄层板时用稀碱溶液（0.1〜0.5N的氢氧化钠溶液）或缓冲液制成碱性硅胶薄板；或者使色谱过程在碱性条件下进行，即在展开剂中加入少量碱性试剂，如二乙胺、稀氨溶液等；或在展开槽中放一盛有稀氨溶液的小杯，用中性展开剂在氨蒸气中进行展开。氧化铝本身显弱碱性，且吸附性能较力胶强，其不经处理便可用于分离和检识生物碱。（2）展开剂：展开剂系统多以亲脂性溶剂为主，一般以氯仿为基本溶剂，根据色谱结果调整展开剂的极性。一般来说，硅胶和氧化铝薄层色谱适用于分离和检识脂溶性生物碱。尤其是氧化铝的吸附力较硅胶强，更适合于分离亲脂性较强的生物碱。分配薄层色谱：用于分离有些结构十分相近的生物碱，可获得满意的效果。（1）支持剂与固定相：常用硅胶或纤维素粉作支持剂，以甲酰胺或水作固定相。（2）展开剂：分离脂溶性生物碱，以亲脂性有机溶剂作展开剂；分离水溶性生物碱，则应以亲水性的溶剂作展开剂。在配制流动相时，需用固定相饱和。吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅硅胶硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至100〜110°C时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升咼至500C时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较咼温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离因离子交换反应而吸附碱性化合物。活性炭一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80C干燥后即可供层析用。常用的显色剂有些生物碱能和某些试剂反应生成特殊的颜色，叫做显色反应，常用于鉴识某种生物碱。但显色反应受生物碱纯度的影响很大，生物碱愈纯，颜色愈明显。常用的显色剂有：（1）矶酸铵一浓硫酸溶液（Mandelin试剂）为1%矶酸铵的浓硫酸溶液。如遇阿托品显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。（2） 钼酸铵一浓硫酸溶液（Frohde试剂）为1%钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。（3） 甲醛一浓硫酸试剂（Marquis试剂）为30%甲醛溶液0.2ml与10ml浓硫酸的混合溶液。如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。4）浓硫酸如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。5）浓硝酸如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。生物碱的显色反应原理尚不太明了，一般认为是氧化反应、脱水反应、缩合反应或氧化、脱水与缩合的共同反应。薄层层析法具体操作注意事项铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G：水=1：2〜3,硅胶G：羧甲基纤维素钠水溶液=1：2.研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。点样尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。点样:体积宜在20ul以下，样径不超过2-3mm，点间距离为1.5-2.0cm,距底2.0cm.展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。［医学教育网搜集整理］温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。显色喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。显色方法：直接喷雾法、浸渍法、压板法1川芎总提物的提取分离本次实验步骤提取川芎嗪取150g川芎饮片，稍粉碎．用95％乙醇于索氏回流提取装置中回流提取9h。溶媒用量为8—10倍。提取液用布氏抽滤器抽滤．抽滤液减压浓缩至干，再加适量水．加热使溶解，抽滤，滤液加到已处理好的大孔树脂柱（干膏和树脂的比倒为1：15—20）上．控制加群流建为3秒／滴，慢慢滴加完后，先用水洗（1—2秒／滴）洗至还原糖反应呈阴性，（1ml水洗脱液加人甲基萘酚0．5％试液2—3滴。沿试管壁缓缓加人0.5ml浓硫酸，阴性为二试液界面处出现棕色环）约用