基因工程基本技术

基因工程基本技术第1页/共51页主要内容核酸提取技术凝胶电泳技术PCR技术DNA重组技术核酸杂交技术基因文库构建基因工程技术重组子克隆第2页/共51页基因工程的基本技术

之一第一节第3页/共51页一、核酸提取技术核酸包括脱氧核糖核酸（

DNA

）和核糖核酸（RNA）;脱氧核糖核酸（DNA

）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。第4页/共51页1、植物组织中基因组DNA的提取思考：DNA如何从细胞中取出？第5页/共51页ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第6页/共51页再思考：1、研磨破碎组织必须在低温下进行。------为什么？2、幼嫩组织DNA的得率高还是低？防止DNA降解。得率高！第7页/共51页ⅱ提取DNA的质量鉴定：

DNA的相对完整性：凝胶电泳

DNA的纯度：测OD值吸收峰：DNA紫外光260nm

蛋白质紫外光280nm比值：OD260/280=1.8-2.0较纯

OD260/280<1.8-2.0杂质多第8页/共51页2、质粒DNA的提取基因组DNA质粒DNA质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。第9页/共51页ⅰ质粒DNA提取方法：碱裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ

碱裂解法原理：

在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。第10页/共51页抽提质粒DNA所需的溶液：§、溶液Ⅰ：50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl

（pH8.0），10mmol/LEDTA(pH8.0)；§、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；§、溶液Ⅲ：3mol/LKAc，用冰醋酸调pH值至

5.2；第11页/共51页实验步骤1、接种、摇菌；2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清；3、加入200μL预冷的含Rnase的溶液I，涡旋混匀；4、加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min；5、加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，冰浴15min；6、离心，吸上清至另一EP管；第12页/共51页7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽提，离心；8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置5min，离心，弃上清；9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉乙醇，吹干；10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小时11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。第13页/共51页ⅲ抽提出质粒的构型：1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。第14页/共51页抽提出的质粒三种构型电泳结果：1）开环

2）线状

3）超螺旋+-电泳方向第15页/共51页DNA的浓缩与纯化（P31-33）♪

DNA的浓缩：

＠乙醇沉淀法

＠正丁醇抽提法

＠聚已二醇浓缩法♫

DNA的纯化：

＠氯化铯－溴化已锭连续梯度离心法

＠离子交换层析法

＠琼脂糖凝胶电泳洗脱法

＠“基因纯”试剂纯化第16页/共51页二、凝胶电泳技术电泳目的：对核酸分子进行分离和检测第17页/共51页琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸分子分离的原因：

在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。电泳类型：第18页/共51页（一）、影响电泳迁移率的因素1、分子本身的影响分子的大小：小则快带电荷数：多则快分子构型：超螺旋>解螺旋2、电场：直流电场电压高则快电压太高则结果不准确常用3~5V/CM第19页/共51页操作简单；分辨范围：100bp-60kb；有效范围：200bp-50kb；分辨率：100bp左右3、支持物介质低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）A种类：琼脂糖（agarose）凝胶：第20页/共51页常用于微卫星、测序分析；分辨范围：5-500bp；分辨率：1bp聚丙烯酰胺凝胶：注意：有神经毒性！！第21页/共51页♦凝胶分辨DNA的能力：

琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶浓度分辨范围(kb)浓度分辨范围(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-500

0.7%0.8-108.060-400

0.9%0.5-71240-200

1.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100B

凝胶浓度:浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小原来如此！第22页/共51页4

、电泳缓冲液

pH值：偏碱性，带负电荷

离子浓度：离子浓度高电流大发热快胶溶解种类：TAE（Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集TBE

（Tris+EDTA+硼酸）:缓冲能力最强TPE（Tris+EDTA+磷酸）:缓冲能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸钠）第23页/共51页电泳缓冲液的选择TBE缓冲力大于TAE；高分子量的DNA选用TAE，否则选用TBE；基因组DNA酶切电泳选用TAE；☆实验技巧：☻问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。解决办法：一是更换成新配置的电泳缓冲液；二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。－－－WHY?大家注意了！第24页/共51页（二）、电泳指示剂和DNA染色剂Ⅰ、类型：溴酚兰，二甲苯青Ⅱ、作用：(1)预知电泳的速率及方向；(2)使样品呈现颜色，便于加样；(3)与一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度。电泳指示剂第25页/共51页DNA染色剂荧光染色剂,溴化已锭：（EB,Ethidiumbromid）吸收300~360nmUV（紫外光）放出590nm可见光（橙红色）硝酸银：常用0.1%Goldview染料吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）第26页/共51页（三）凝胶电泳过程1、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒入制胶槽配制；2、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶2－3mm,3、点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样4、电泳：接通电源，调好电压5、看结果：紫外光观察。第27页/共51页1、单向电泳2、脉冲电场电泳（CHEF）3、反转电场电泳（FIGE）（四）、电泳种类－＋第28页/共51页中文名称：聚合酶链式反应1、PCR原理：

变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。技术3：PCR技术(polymerasechainreaction)第29页/共51页PCR操作流程94℃50℃72℃第30页/共51页2、

PCR反应过程：变性：DNA双链变为单链；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。第31页/共51页3、PCR反应体系：体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。第32页/共51页1）、引物（寡聚核苷酸）§一般成对出现，长度为15-30个核苷酸；§使用浓度：0.1-0.5uM，高达1uM；§引物设计原则：

1、G+C含量45-55%；

2、Tm值高于55；

3、引物特异性；

4、引物扩增跨度；

5、是否形成引物二聚体第33页/共51页2）、模板DNA：

§基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段；

§质量要求：不高3）、Taq酶(热稳定性)：

§常规酶

§高保真酶：ExTaq§LaTaq酶4）、反应缓冲液成分：

§BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用

§Tris.cl提供缓冲作用第34页/共51页§(2)、

dNTP的浓度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性；

4、影响PCR产量、质量的因素：§(1)、

Taq酶：常用1U/25µL

浓度低，扩增产物不够；

浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；第35页/共51页§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.§(4)、引物浓度：

0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；§(5)、

Mg2+浓度：常用0.5-2.5mmol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性第36页/共51页

§(6)、

PCR反应程序设定：(1)、变性温度和时间：

要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃（2小时）95℃（40min）97℃（5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。(2)、引物退火温度Tm与时间；

Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃，G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒(3)、引物延伸温度与时间：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq(4)、循环数：

25-35cycles之间，过多则非特异扩增增加；平台效应；第37页/共51页以普通PCR50lreactionsolution为例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）§反应体系配置：第38页/共51页§

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循环数HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature设计的反应程序相应作用第39页/共51页6、PCR的种类RT-PCR特异PCR锚定PCR反向PCR套式PCR不对称PCR长程PCR锅柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR第40页/共51页

F

R（1）特异PCR

扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTT第41页/共51页（3）反向PCR：根据已知序列扩增两侧序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作过程：酶切基因组DNA连接环化目的DNA用引物1和引物2组合扩增出侧翼序列第42页/共51页（4）定量PCR用途：分析基因组中某个基因的拷贝数或分析基因的转录表达丰度。第43页/共51页

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。概念：第44页/共51页

原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T)值之间呈线性关系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

第45页/共51页ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值Ct值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含义是：