基因扩增技术

基因扩增技术第1页/共67页Polymerasechainreaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。PCR的定义第2页/共67页PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。1993年获诺贝尔化学奖第3页/共67页PCR的种类&RT-PCR(关于热启动，一般要求把反映体系加好后，最好立即开始反映，这时就要安排好时间，最好先把机器开好，等到85度以上，把体系加进去，这样就会防止引物2聚体！一般引物2聚体的形成温度为60度左右！超过了此温度就可有效防止其形成。）&反向PCR&不对称PCR&多重PCR&巢式RT-PCR

&实时定量荧光PCR第4页/共67页PCR温度循环参数变性(denature)温度和时间模板DNA的变性：模板DNA双链在93-96加热2’-10’解离；经

PCR扩增形成的双链DNA在93-96°C加热30”-1’。退火(anneal)温度和时间:Tm-5°C

温度降至55C左右，特异引物与模板DNA单链配对结合。延伸(extend)温度和时间：

72°C1000碱基/分钟在TagDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。循环数在25~30个循环内，扩增的DNA量增加明显，然后进入平台期。靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。第5页/共67页PCR扩增效率（理论）以上三步为一个循环。每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，从理论上讲，每经过一循环，样本中的DNA量应该增加一倍，扩增DNA产量是以指数形式上升的，既n个循环后，产量为2n，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。第6页/共67页PCR扩增效率（实际）实际上，PCR扩增效率比理论值要低。对于不同的基因来说，扩增效率也大不相同。(如图所示)经过一定循环数之后，PCR产物的量增长缓慢，进入所谓的“平台期”，在PCR扩增反应达到平台期前，模板扩增产物(N)与启始模板(N0)之间呈下列方程所示关系:N=N0(1+E)n其中E是扩增效率，n是循环数。演示PCR反应的过程！第7页/共67页PCR反应体系组成（1）DNA模板（2）引物（3）dNTP（4）耐热的DNA聚合酶（5）10×PCR缓冲液(含Mg++)第8页/共67页模板核酸PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。RNA的扩增必须经逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环，称为RT-PCR。PCR反应中模板加入量一般为102-105个拷贝的靶序列。第9页/共67页人工合成的寡核苷酸-引物

PCR扩增产物的特异性和扩增片段的大小是由引物限定的，因此，引物的设计对PCR的成功与否有决定性的意义。第10页/共67页引物设计原则：软件+经验引物长度以15-30个碱基为宜；引物碱基尽可能随机分布，G+C含量宜在45~55%左右；引物内部不应形成二级结构；两个引物之间不应形成二级结构；引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；两个引物的Tm值要尽可能接近。

第11页/共67页一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。引物浓度对PCR反应的影响第12页/共67页合适的缓冲体系

目前最常见的缓冲体系为10~50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。Tris是一种双极性离子缓冲液，其主要作用是维持碱性的Taq酶作用环境。在缓冲液中加入明胶或无核酸酶的BSA，对酶有一定的保护作用，Tween-20(0.05%-0.1%)及5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用。尤其在扩增长片段（延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。

第13页/共67页Mg2+

Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。因为，PCR反应混合物中的DNA模板、引物和dNTPs的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+的实际浓度。TaqDNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，因此，PCR中的Mg2+的加入量要比dNTPs的浓度要高0.2-2.5mmol/L。最好对每种模板DNA,每种引物都进行

Mg2+浓度的优化。（一般Mg终浓度为1.5umol/l,不见带时加到1.8但要小于3，见杂带时但应大于1.0）第14页/共67页三磷酸脱氧核苷（dNTPs）四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20~200mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降，dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制TaqDNA聚合酶的活性。第15页/共67页耐热DNA聚合酶

Taq聚合酶是从耐热菌（thermusaquatious）中提取出来的耐热酶，95℃仍有活性。该酶的应用浓度一般为1~2.5U/100L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。酶浓度过高时，会出现非特异性扩增；过低时扩增产物量很低。

第16页/共67页试剂 原液浓度 工作浓度 50l体系PCR缓冲液 10 1 5L上游引物 50mol/L 0.5mol/L 0.5L下游引物 50mol/L 0.5mol/L 0.5LdNTPs 10mmol/L 200mol/L 4LMgCl2 25mmol/L 1.5mmol/L 1.5LTaq酶 5U/L 2.5U/100L体系 0.25LDNA模板 102-105拷贝ddH2O 补足50LPCR混合液第17页/共67页PCR产物的分析半定量RT-PCR原理：持家基因：在所有类型组织和细胞中普遍表达恒定的基因。如2微球蛋白、-肌动蛋白和GAPDH基因。在逆转录过程中，“持家基因”的mRNA与待测模板的mRNA共同逆转录为cDNA，因此排除了cDNA合成效率不同所引起的误差。在此后的PCR反应过程中，“持家基因”的cDNA与待测模板cDNA用不同的两对引物在同一PCR体系内扩增。待测模板扩增产物与该样品“持家基因”扩增产物的比值可以反映待测模板表达量的相对高低。

第18页/共67页持家基因选择的原则在欲分析的组织或样品中该持家基因的表达稳定。RNA特异性的检测，注意假基因的干扰。持家基因的拷贝数和预测基因的拷贝数在同一线性范围内。第19页/共67页常用持家基因表达的稳定性第20页/共67页常用持家基因在基因组序列中存在假基因情况第21页/共67页不同类型细胞中持家基因表达的稳定性Vandesompele,J.,K.DePreter,etal.GenomeBiol,2002第22页/共67页不同类型组织中持家基因表达的稳定性deKok,J.B.,R.W.Roelofs,etal.LabInvest,2005第23页/共67页在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性Fig.SelectionofthemostsuitablereferencegenesfornormalizationinprostatecancersamplesusinggeNormanalysisbycalculatingtheaverageexpressionstabilitymeasureM,andtheleaststablegenewiththehighestMvalue.Ohl,F.,M.Jung,etal.JMolMed,2005第24页/共67页PCR产物的分析如何调整PCR产物在直线期：一管PCR法（减少持家基因引物量）两管PCR法（同一混合液，同一PCR程序）如何调整不同样品间持家基因的差异RNA水平调整（加大模板量）cDNA水平调整（加大模板量，最多2uL)电泳水平(持家基因与欲测基因体积一致）第25页/共67页待测模板的相对含量=样品荧光强度/内参照模板的荧光强度第26页/共67页RT-PCR实验的策略1、热启动

Taq酶在低温下仍有活性，故PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，Taq酶可催化引物与模板的非特异复性或引物二聚体的形成。在第一个循环的变性温度加入Taq酶；将含有Mg2+的石蜡珠放在管内，待达到变性温度时，石蜡熔化，Mg2+进入反应液中，起始反应；在PCR反应液中，加入Taq酶的单克隆抗体，在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体与Taq酶结合，使其不能发挥作用。第27页/共67页RT-PCR实验的策略2、优化Mg2+浓度应用不包含Mg2+的PCR缓冲液，将10mmol/LMgCl2贮存液逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mmol/L），在确定了Mg2+大概浓度后，再在该浓度上下，以0.2mmol/L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最合适的浓度。第28页/共67页RT-PCR实验的策略3、退火温度和时间Tm=4(G+C)+2(A+T)简单计算法从退火温度低于Tm值5C开始，由低往高优化。欲增加DNA扩增产物，可在前5个循环增加退火时间，如2分钟，其次的循环中退火时间为1分钟。4、缩短合成时间（适用于非特异大片段）第29页/共67页RT-PCR实验的策略5、模板中G+C比例过高可加1-10%二甲基亚砜（DMSO），使模板易于解链和引物特异性的结合。6、若不出DNA扩增带，用持家基因引物做PCR，首先排除模板问题，在依次寻找其它原因，引物不特异、退火温度过高、Mg2+浓度不合适或试剂出现问题等。第30页/共67页7、对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录。8、对长片段的策略。RT-PCR实验的策略第31页/共67页PCR污染的对策

1、隔离不同的实验操作区，将提取RNA操作区、引物分装区、PCR操作区及PCR产物分析区分开；2、分装试剂，把试剂分装成小份，在冰箱中保存。目的是为了减少重复取样所造成的污染；3、改进实验操作，实验时戴一次性手套，加样中要避免反应液的飞溅。在操作多份样品时，要制备标准混合液，将各组分混匀后再分到不同的管，这样可以减少操作污染，并且提高微量加样的精确度。第32页/共67页PCR污染的对策4、设置对照阳性对照：用已知的阳性模板；阴性对照：加无关的或不加模板DNA;重复实验：为防止因各种原因引起的实验误差，应进行反复验证，以确保实验结果的重演性。第33页/共67页污染的处理酸处理：用1M的稀盐酸擦拭或浸泡污染器件，可促进DNA脱嘌呤；紫外灯照射：UV波长一般选择254/300nm，照射30分钟即可。紫外照射可促使DNA形成二聚体，阻止链的延伸。紫外照射对长片段的DNA有效，对短片段效果不大。第34页/共67页巢式PCR(nestedPCR)对于极微量的靶序列，一次扩增很难取得满意的效果，则可用巢式PCR进行多次扩增。引物之间的关系如下图所示：引物1和引物4进行第一次扩增，其产物作为模板，用引物2和3作为再次PCR的引物。如果一次PCR产物在凝胶上有可见的条带，二次PCR只能用第一次PCR产物的1/104-105为模板。第35页/共67页实时定量荧光PCR实时PCR（realtimePCR）是1996年以来发展起来的一种新技术。1、荧光定量PCR技术的整个操作过程在完全封闭的状态下进行，有效的避免了“假阳性”的实验结果。2、荧光探针的使用提高了检测灵敏度和特异性，并能够准确定量样品的模板数。3、PCR扩增后不需进行电泳等后处理，而直接定量样品模板数，使其具有分析时间短，重复性好、省力、低费用等优点。第36页/共67页TaqMan探针ATaqMan探针同时带有荧光报道子和淬灭子，无荧光信号发生；B在退火阶段，引物和探针同时与模板结合；C在延伸阶段，Tag酶将探针水解，报道子被切割，使得荧光信号释放，荧光信号的强弱与模板的量成正比。第37页/共67页荧光染料掺入法

某些染料能够特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，而且与双链DNA结合后的染料发光强度会明显增加，检测结合到双链DNA上的荧光染料发出的荧光可实时监测PCR扩增产物的数量。SYBRGreenI是一种结合于DNA双螺旋小沟中的荧光染料。其最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。优点：1、由于它与所有的双链DNA相结合，不因模板不同而特别定制通用性好，且价格相对较低。2、由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此其灵敏度很高。缺点：1、由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，引物二聚体、单链二级结构以及非特异扩增产物可引起假阳性。因此，只限于分析特异性扩增产物；（可用溶解曲线分析产物的特异性）染料可影响扩增效率。第38页/共67页实时定量PCR的Ct值概念Ct值是实时定量PCR技术中进行定量的一个重要参数。阈值是显著大于背景信号的荧光信号值。它总是出现在扩增的指数期。达到荧光阈值所需的最小循环数为Ct值。在反应的起始，模板数越多，达到荧光信号阈值所需的循环数越少。第39页/共67页实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的荧光曲线图(SYBRGreenI掺入法)第40页/共67页实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的熔解曲线图（单一峰表明产物是单一的，无非特异扩增）第41页/共67页实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1的表达WellGeneCt∆Ct-∆∆Ct2-∆∆Ct

controlGAPDH13.9937.83001TGFb1plasmidGAPDH14.8335.264-2.5665.922TGFb1plasmid+siRNAGAPDH13.4757.8470.0170.988controlTGFb121.823

TGFb1plasmidTGFb120.097

TGFb1plasmid+siRNATGFb121.322

∆Ct=目的基因的Ct值-内参照基因的Ct值∆∆Ct=实验组样品的∆Ct-对照组样品的∆Ct第42页/共67页实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1表达的柱形图第43页/共67页TaqMan探针检测PSA质粒（107拷贝至103拷贝）的荧光曲线图第44页/共67页TaqMan探针检测PSA质粒的Ct值得出的标准曲线y=-0,23x+11,06;r2=0,993（y是模板的对数，x是Ct）第45页/共67页实时PCR定量检测将LNCap细胞梯度掺入到4ml外周血中PSA的表达（TaqMan探针方法）第46页/共67页根据回归方程和Ct值，计算的得到的PSA的拷贝数(之间相差没有10倍，可能是扩增效率的原因，因为扩增质粒的效率是最高的）掺入的LNCap数CtPSA的拷贝数1/4m