基因工程2目标基因分离课件

第二章目的基因的克隆策略一、基因克隆的目的与意义

Isolationofgeneofageneenablesthedeterminationofitsnucleotidesequence.Fromthisinformationtheinternallandmarksofthegenecanbedetermined–forexample,intronnumberandposition;promoterelements.

AcomparisonofDNAsequencesbetweengenescanleadtoinsightsingeneevolution.ConvertingtheDNAsequenceofageneintoaminoacidsequencebyusingthegeneticcodeleadstoadeterminationofthestructureoftheproteinproductofthegene,andfromthisknowledge,thefunctionofthegenecanbeinferred.

Agenecanbemovedfromoneorganismtoanother.Anorganismcontaininga"foreign"geneviageneticengineeringprocessiscalledtransgenic.Transgenicorganismscanbeusedeitherforlaboratoryresearchtoadvanceourunderstandingofbiologicalprocessesorforspecializedindustrialapplications–forexamples:·DevelopmentofinsectresistantcropsProductionofhumaninsulinintransgenicbacteriacarryingappropriatehumangeneForwardGenetics

isanapproachthatencompassesseveralmeansofidentifyingthegeneorsetofgenesthatareresponsibleforaparticularphenotypewithinanorganism.Initially,thisentailedthegenerationofrandommutationsinanorganism,oftenthroughradiation,andthenthroughaseriesofbreedingofsubsequentgenerations,isolatingindividualswithanaberrantphenotype.Todaytherearemanydifferentmeansoffollowingthegeneralpathofalteringthegenotypetoobservethephenotype,severalofwhichwithinthegenomiceracanbeusefulinthestudyof

functionalgenomics.图位克隆方法，这种方法又称定位克隆（positoinalcloning），1986年首先由剑桥大学的AlanCoulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和疾病的生化机制。图位克隆方法分离基因的优点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。二、图位克隆（Map-basedcloning）法（未知序列的基因克隆）٭

90年代初发展起来的基因克隆技术。很多分离克隆的基因都是通过这种方法获得的。٭

图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克隆基因的方法。٭

图位克隆法包括以下步骤：(a)Targetgenemapping:ahighresolutiongeneticmapwithaveragedistanceislessthan5cM.(b)

Physicalmapping:amapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA,regardlessofinheritance.Distanceismeasuredinbasepairsotherthangeneticrecombination(incM).(c)

Chromosomewalkingandlanding:--ChromosomewalkingreliesonisolationofaDNAfragmentatornearanendofaclonedinsertforuseasaprobetoscreenthelibraryandidentifymoreclones.--Chromosomallanding:Itisbasedontheprinciplethattheexpectedaveragebetween-markerdistancescanbesmallerthantheaverageinsertlengthofaclonelibrarycontainingthegeneofinterest(d)Geneidentification:Geneticcomplementationthroughtransformation.文库片段测序Genscan和Blast，候选基因确定转基因功能验证Fig.1Acontigmapcoveringthexa13region.Thelonghorizontallinesindicatetheregioncontainingthexa13locus.TheshorthorizontallinesrepresenttheBACclones.ThenumbersbetweenmolecularmarkersindicatethegeneticdistancesincentiMorganandthenumberofrecombinationevents(inparentheses)detectedbetweenthexa13locusandthecorrespondingmarkers.TheunderlinednumbersrepresentgeneticdistancesandrecombinationeventsdetectedinthethirdF2populationandothernumbersrepresentgeneticdistancesandrecombinationeventsdetectedinthesecondF2population.FineMappingof

xa13,aresistantgenetoriceblastdiseaseChuetal.Thoer.Appl.Genet.2006,112:455–461Duetal.Proceed.Natl.Acad.Sci.USA2009,106:22163-22168Map-basedcloningof

Bph14,aresistantgenetoricebrownplanthopper例如：克隆大肠杆菌Leu合成酶构建Wt基因文库Leu营养缺陷型转化Leu-筛选挑取单菌落抽质粒测序利用这种方法，有可能从一个基因文库中分离出许多种不同的基因。取决于获得的突变体种类。**只有细菌的染色体基因和少数几种其它物种基因，如酵母这样的低等真核生物的基因，才能同大肠杆菌的营养缺陷型互补；才有可能通过这种方法克隆。真核基因和原核基因在结构上存在很大差异，不可以通过大肠杆菌的功能互补体系进行克隆。必须发展真核生物体系。四、同源序列法

根据植物同一类基因存在保守序列的特点，利用同源序列分离克隆基因，可以是同种植物也可以是不同种植物；或者是根据某种植物中克隆的基因序列，分离克隆其它植物同种基因的方法。PCR

扩增同源序列NBSLRR筛选文库或已克隆的抗病基因基因互补分析如系未知功能的抗病基因，则需进行大量的抗病接种鉴定例如：抗病基因的克隆注：NBS：nucleotidebindingsequenceLRR:Leucine-richrepeat覆盖Rx1起始和终止密码的PCR引物扩增含Rx2的总DNA200个同源序列构建转化载体Rx1-Pro同源序列Rx1-Ter野生型马铃薯含PVX无毒基因的转基因马铃薯无过敏反应过敏反应转化Agoinfiltrationtransienttransformationgenetogenehypothesis五、mRNA差异显示法(未知序列基因克隆）mRNAdifferentialdisplay3’锚定引物AGAAAAA···AACGAAAAA···AAGGAAAAA···AATGAAAAA···AAATAAAAA···AACTAAAAA···AAGTAAAAA···AATTAAAAA···AAACAAAAA···AACCAAAAA···AAGCAAAAA···AATCAAAAA···AA5’随机引物(10bp)放射性标记dNTPLiangetal.Science1992,257:967-971•ReamplifyandconfirmbyNorthernblot•Cloneandsequence•Conductfurtherstudies:Cutoutdifferentiallyexpressedbandsand:•Generatefull-lengthcDNAs•Obtaingenomicclonesorregulatorysequences

※扣除杂交是比较两个群体的mRNA表达差异，从而克隆仅在其中一个群体中表达的基因的有力的方法。

原理：首先，把两个群体分离的mRNA反转录成cDNA；我们把含有特异基因表达的群体的cDNA做“tester”，参照群体的cDNAs为driver；然后在driver过量的情况下将两者进行杂交，除去杂交的序列；结果，那些未杂交的cDNAs即是tester中特异表达的mRNA.六、抑制性扣除杂交法(未知序列基因克隆）（suppressionsubtractivehybridization,SSH)

※特别实用于分离在特定组织中表达的基因，在细胞周期特定阶段表达的基因，受生长因子调节的基因，以及在特定发育阶段表达的或者是参与发育调节的基因。同时亦可有效分离经特殊处理而诱导表达的基因。Diatchenkoetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996,93:6025-6030工作流程：cDNAsynthesisTesteranddriverdscDNAarepreparedfromthetwomRNAsamplesundercomparisonRsaIdigestionTesteranddrivercDNAareseparatelydigestedtoobtainshorter,blunt-endedmoleculesAdaptorligationTwotesterpopulationsarecreatedwithdifferentadaptors,butdrivercDNAhasnoadaptorsFirsthybridizationHybridizationkineticsleadtoequalizationandenrichmentofdifferentiallyexpressedsequencesSecondhybridizationTemplatesforPCRamplificationaregeneratedfromdifferentiallyexpressedsequencesFirstPCRamplificationUsingsuppressionPCR,onlydifferentiallyexpressedsequencesareamplifiedexponentiallySecondPCRamplificationBackgroundisreducedanddifferentiallyexpressedsequencesarefurtherenrichedPlantPhysiol.138:2087-2096,2005SSH实例1：分离耐低磷基因SSH文库的检测SSHcDNA文库的macroarry检测候选克隆的Northern验证通过SSH的方法分离到螟虫诱导性的启动子七、酵母双元杂交系统YeastTwo-hybridSystem1、酵母双元杂交系统的应用•验证传统方法检测的相互作用的蛋白•蛋白的功能作图–功能域/氨基酸•鉴别新的相互作用蛋白(fromacDNAlibrary)本项技术已被广泛地应用于真核基因的表达和调控、细胞粘合因子间的相互作用、信号传导路径以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域。•Gal4proteincomprisesDNAbindingdomains(BD)andactivatingdomains(AD)•Bindingdomaininteractwithpromoter•Activatingdomainwithtranscriptionmachinery背景知识Gal4双元系统介绍背景知识•Gal4protein:thetwodomainsoftheproteindonotneedtobetranscribedinasingleprotein•JustaslongastheyarebothrecruitedtothepromotorGal4背景知识ChimericproteinsPlasmidscarryingdifferentconstructscanbeexpressedinyeastBindingdomainasatranslationalfusionwiththegeneencodinganotherproteininthesameplasmidActivatingdomainasatranslationalfusionwiththegeneencodingathirdproteininasecondplasmidPlasmidvectors背景知识背景知识作用机制Yeasttwo-hybridsystem实例Wuetal.Cell.2006,125:1347-1360作用机制作用机制作用机制作用机制八、T-DNA、转座子标签法T-DNA/Transposontagging利用同源或异源转座子(如玉米的Ac/Ds系统)、T-DNA随机插入基因组中引起基因失活，产生出易识别的突变表型的特点，鉴定未知基因。然后，通过分离转座子两侧的宿主基因组的DNA序列，从文库中分离目的基因。原理：筛选文库候选基因基因互补分析不同类型的转座子有不同的转座热点和转座频率单个位点Mutator的诱变频率约10-4－10-6九、功能基因组研究与大规模T-DNA插入突变体库的构建（扩展内容）1.人类基因组计划与全基因组测序HumanGenomeProject(HGP)人类基因组（HGP）计划1984.12

犹他州阿尔塔组织会议1985Dulbecco在《Science》撰文“肿瘤研究的转折点:人类基因组的测序”

。美国能源部(DOE)提出“人类基因组计划”草案1987美国能源部和国家卫生研究院（NIH）联合为“人类基因组计划”下拨启动经费约550万美元1989美国成立“国家人类基因组研究中心”，Watson担任第一任主任1990.10美国国会批准，人类基因组计划正式启动1992.6CraigVenter离开NIH，建立基因研究所（TIGR）。TIGR从流感嗜血菌(H.inf)开始进行细菌基因组测序。1995TIGR完成第一个自由生物体流感嗜血菌(H.inf)的全基因组测序。1998.5CraigVenter成立公司（即后来的Celera公司），计划用全基因组霰弹法对人类基因组进行测序1999.7第5届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度1998公共组完成人类基因组计划的物理作图，开始人类基因组的大规模测序2000.6.26公共组和Celera公司共同宣布完成人类基因组工作草图2001.2.15《Nature》刊文发表国际公共领域结果2001.2.16《Science》刊文发表Celera公司及其合作者结果PublicsectorVsprivatesectorFrancisCollins&CraigVenterHumanGenomeProjectCompletein2003Projectgoalsweretoidentifyalltheapproximately20,000-25,000genesinhumanDNA,determinethesequencesofthe3billionchemicalbasepairsthatmakeuphumanDNA,storethisinformationindatabases,improvetoolsfordataanalysis,transferrelatedtechnologiestotheprivatesector,andaddresstheethical,legal,andsocialissues(ELSI)thatmayarisefromtheproject.基因组测序的常用策略策略Clonebyclone(map-based)Whole-genomeshotgun（WGS）全基因组测序统计表（NCBI）Source：动物：猪（2800Mb），黑猩猩（3100Mb），果蝇（两个种140/210Mb），线虫（97Mb）植物：拟南芥（120Mb），水稻（390Mb），玉米（2400Mb）2.功能基因组及其研究内容功能基因组学主要通过发展和应用基因组水平的实验方法来研究生物体内各基因的生物学功能进而了解所有基因如何协调发挥作用完成一系列的生长发育过程。同时功能基因组研究还将从表达时间、部位和表达水平三个方面对目的基因在生物体中的精细调控进行系统研究。功能基因组学研究的最终目标是从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能，全面研究控制生物生长发育及响应环境变化的遗传机制，在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用，共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任。PhilipHieter,etal.FunctionalGenomics:It’sAllHowYouReadIt.Science.278,601(1997)功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)全长cDNA克隆与测序；(2)获得DNA芯片等基因转录图谱；(3)突变体库的构建；(4)高通量的遗传转化鉴定系统；(5)生物信息技术平台与相应数据库的构建；(6)研究基因组表达的全部蛋白质及其相互作用为主要内容的蛋白质组学（韩斌，2003）。3.植物突变体库的创建方法理化诱变（甲基磺酸乙酯/EMS，辐射等）农杆菌介导的T-DNA插入标签（Genetrap）植物转座子标签（Ac/DS，En/Spm）水稻Tos17反转录转座子

获得功能突变体（激活标签法/Activationtagging）RNA干涉技术和人工microRNA等等Enhancertrap,Genetrap和Promotertrap载体结构示意图（Springer，2000）

基因trap的三种类型EnhancerTATAGAL4-VP16UASBoGUS/mGFPUASGeneXRBRBLBLBEnhancertrap中的GAL4-UAS系统P=1-(1-[x/G])nArabidopsis120,000kb;Rice389,000kb插入突变体库的大小估算公式：Itwasestimatedthat365380insertionsareneededtosaturatethegenomewithP=0.95xistheaveragesizeofthericegene,whichis3.05kbforrice,Gisthegenomesize,nisthenumberofinsertionsneededtoobtaintheprobability(P)ofgenomesaturationZhangetal.PlantJ2007,49:947–959T-DNA插入引起的后果（Kryson等，1999）

4.侧翼序列（Flanked-sequencetag,FST）的分离方法

热不对称交错PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，TAIL-PCR）反向PCR（InversePCR，IPCR）质粒拯救（Plasmidrescue）接头PCR（adaptorPCR）其他方法TAIL-PCRADprimer：任意简并引物（ArbitraryDegeneratePrimer）反向PCR质粒拯救接头PCR>GNAGNAANGCCTTTTATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGTTTAAACTATCAAGTGTTTGAACCTTACATGCATGCACCAAGTGCAGTTTGATTAATTAATGGGAAAAGGCAATCAGCTAATCATGCAGTAATCCCCCATTGCAAGAATTAAGGGAACCAACCACAAGAGTGGCCAGAGGAAGCAACAAAAGGACATCATCATATTTGCCTTGCTTTGTGGCCTTAATTGTATATATATTGTATCCTTCTCTTCTTCACCTAGCTAGCTTAACTATATTTAGCTGCATATCTATCTTTTGGTACTAATGATTTGTTACAGACACATCTAACAATGCACTTTTAGATTCTTCTCTAACCTCCCAGGCTCATCCTTCTAATAGTAAAATGCTTGAGGTCTGCCACTAATAATATTGNAATAAGTTCCGACACTAGGAGTGGTTAAAGATAACTTGATCAATTTCGTCAAACGAGAATACTATTATGCCCATGCTTGCAACTAGTANGATTTGATTCCGCACGCATACACACAAGGTTGGGGCTTCAACATCCGCCTAAAAAATCTAATTATAAAAANAAAGGGTGCAGTTTAAAGAAAACATGTTGGGGGTACAATACATAAGTAATTTCATCTTAACCCCGNTTATCGGGGANTATNAAATGGTTNANNTNNANGGTTNANAAGGGGNCCATTTNGAANTNANTNNNNTTGGCGTANGNNGNNGAATATNAAANCCGNCNANCNNNANAAC03Z15AI83ZH15CK561bp03Z15AI83RBflankingsequence

Ricegenome只可以通过序列比对来检索是否有对应的基因突变体。最大的特色是提供了大量的外观突变表型描述与图片、胁迫筛选结果和基因表达谱等信息，内容丰富。研究者可以根据序列来检索本库，也可以根据突变表型，表达模式和发育时期来检索出现感兴趣性状的突变体，更为直观、快捷地找寻目标突变体。

ShanghaiT-DNAInsertionPopulation(SHIP)

特色在于大量关于水稻品质方面的突变体数据T-DNA插入突变体库澳大利亚水稻Ac/Ds以及T-DNA插入突变体库转座子插入突变体库Tos17插入突变体库同时收录了多家突变体库的数据，丰富全面。整合了多家科研单位的水稻T-DNA，Tos17和Ac/Ds转座子的侧翼序列，能提供基因组浏览器的功能，信息更新比较及时，同时还提供拟南芥突变体库的相关信息。综合类数据库6.FSTResourcesGroupSequenceMappedUpdateRMD(FST)16,15815,97108/25/2007POSTECH(T-DNA)85,26784,680/58,943lines04/28/2008Eu-CIRAD/Genoplante29,26328,32410/22/2007NIAS(Tos17)18,02417,93708/25/2007UCD(dSpm/Ds)13,92213,66607/29/2008TRIM(FST)11,79911,64606/05/2008SHIP(T-DNA)6,9626,76108/25/2007EU-OSTID(Ds)1,3151,30108/25/2007PSNU(Ds)1,0721,04608/25/2007ZJU(T-DNA)74171408/25/2007CSIRO(FST)61158908/25/2007Total185,134182,6