DNA体外重组技术

DNA体外重组技术第1页/共96页DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA

。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloning)。

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※

“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinantDNA)。

※实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。※基因工程目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）第3页/共96页二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取连接物（重组DNA)导入合适受体细胞目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建重组体的筛选克隆基因的表达

分、切、接、转、筛第4页/共96页第5页/共96页第6页/共96页（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、载体的分类克隆型载体表达型载体原核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）原核克隆型载体原核表达型载体真核转递型载体真核表达型载体质粒载体噬菌体载体病毒载体酵母人工染色体载体粘性载体第7页/共96页

细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:

是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1.质粒(plasmid)的特征第8页/共96页1.质粒的特征功能：使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。性质：具有不相容性按拷贝数分类：严谨性（低拷贝）松弛型（高拷贝）第9页/共96页克隆用质粒载体应具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。2.质粒载体的分类:

克隆载体和表达载体（1）克隆用质粒第10页/共96页抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解ampβ-内酰胺环使amp失效四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落变为蓝色。第11页/共96页*lacZN端146aa残基编码基因*lacZ编码产物为β半乳糖苷酶α片段（N端）,突变型lac–E.coli可表达该酶的ω片段（C端)，两片段单独存在无活性

*两端同时存在时有活性蓝色化合物

α互补（αcomplementation）*在LacZ基因内无外源DNA的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落阴性克隆。*在LacZ基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落阳性克隆。第12页/共96页

X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因α互补筛选-蓝白斑筛选外源DNA插入白色IPTG诱导异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类似物第13页/共96页α互补筛选法-（2’37’’）阴性克隆阳性克隆第14页/共96页AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr,

Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因第15页/共96页AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：MultipleCloningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆第16页/共96页pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)OriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS*pUC18/pUC19的MCS方向相反第17页/共96页pMD-18Tsimple克隆载体的结构

第18页/共96页2.质粒载体的分类:（2）表达用质粒载体：除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终止子等分类：

原核表达载体真核表达载体第19页/共96页pET-32a(+)原核表达载体的结构

*pET系列的基本结构：T7启动子、MCS、T7终止子、Ampr等Amprlac*可将T7RNA聚合酶基因置于lac启动子的控制下第20页/共96页pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子

驱动目的基因在真核细胞内表达BGHpA：加尾信号

目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。第21页/共96页（二）噬菌体

AWBDEFZ

JattxisNclcroOPQSR

结构区

重组区调控区裂解区cos末端

cos

末端ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型第22页/共96页

噬菌体作为载体具有两个特点①噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。②噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%～105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体的种类：Charon系列、gt系列、EMBL系列第23页/共96页（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志噬菌体：cos粘端序列插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍第24页/共96页（四）酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵母基染色体中心粒端粒复制起点顺序复制起点(ori)Ampr基因组成用途构建真核生物基因组DNA文库能携带更大（1Mb）的插入片段第25页/共96页第二节基因工程中常用的工具酶第26页/共96页一、限制性核酸内切酶

(restrictionendonuclease，RE)

是能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：切——基因工程的手术刀第27页/共96页Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）

切——基因工程的手术刀分类：一、限制性核酸内切酶命名：Hin

dⅢ

属

种

株序Haemophilusinfluenza

d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第28页/共96页Ⅱ类酶识别序列特点

识别顺序一般为4～6个碱基，通常为回文结构(palindrome)(核苷酸序列呈二元旋转对称,180°反向重复）切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第29页/共96页BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口平头或钝性末端（bluntend)

粘性末端（stickyend)第30页/共96页

产生5

突出黏性末端

(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—第31页/共96页

产生3

突出黏性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********第32页/共96页酶单位定义：

在适当反应条件下，1h内在50μl体系中完全酶解1μg特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。

出售的内切酶几乎均以λ噬菌体DNA作底物测其酶活性单位。酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳第33页/共96页二、DNA聚合酶含3种酶活性：1.大肠杆菌DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性

3′→5′外切酶活性

5′→3′外切酶活性催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5′→3′外切酶活性)主要用途DNA序列分析应用：第34页/共96页二、DNA聚合酶2.Klenow片段随机引物标记法标记探针主要用途双脱氧末端终止法进行DNA测序cDNA第二链的合成DNA3′突出末端进行末端标记用途：(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→3′外切酶活性)#38.第35页/共96页323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸

5核酸外切酶活性DNA聚合酶活性

N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠ

Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

第36页/共96页二、DNA聚合酶PCR反应主要用途DNA测序用途：3.TaqDNA聚合酶(65kD)耐热，在70～75℃时具有最佳的生物活性，无3′→5′外切酶活性(无校正功能）#40.第37页/共96页3´5´外切酶活性的功能校读（proofread）功能17/62将错配的核苷酸从引物链的3′端除去

第38页/共96页

（1）反转录活性：即以RNA为模板合成DNA(主）

（2）RNaseH活性：水解RNA-DNA中的杂合分子中的RNA（3）DNA-pol活性：以DNA为模板合成DNA4.反转录酶(ReverseTranscriptase,RT)二、DNA聚合酶第39页/共96页反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA模板反转录活性DNA-RNA

杂化双链RNaseH活性单链DNADNA-pol活性双链DNA第40页/共96页三、DNA连接酶(DNAligase)

——基因工程的缝纫针*催化双链DNA相邻碱基5′-P和3′-OH间磷酸二酯键形成的酶。*T4噬菌体DNA连接酶最常用

①催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端)

5′-P和3′-OH之间形成磷酸二酯键。*主要功能与用途：催化平末端连接要比粘性末端效率低得多。②修复双链DNA分子中单链缺口。第41页/共96页四、其他修饰酶功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3′-OH末端。(一)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)

用途：1.

主要作用是在载体或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2.DNA3′末端的同位素标记。第42页/共96页催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的5′磷酸基团水解。用途：1.

在连接反应中去除载体DNA片段5′-P，防止载体自我连接.2.

用32P标记5′末端时，用此酶去除5′-P，再用激酶进行5′的32P标记.(二)碱性磷酸酶功能：(三)多聚核苷酸激酶(四)RNase(五)DNase第43页/共96页第三节目的基因的获得和修饰分第44页/共96页一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因从原核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因获得已知的基因构建RT-PCR文库法并获得未知基因计算机克隆第45页/共96页三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选基因组文库(genomiclibrary，G文库)：将基因组DNA用内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，再将其导入适当的宿主细胞，

宿主细胞中克隆载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。G文库构建方法：鸟枪法分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术第46页/共96页组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌从基因组DNA文库获取目的基因第47页/共96页

cDNA文库(cDNAlibrary，C文库)：

将细胞内所有mRNA逆转录为cDNA，再将所有cDNA片段克隆到适当的载体中，并将其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是C文库。C文库构建方法：

反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术第48页/共96页mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库获取目的基因第49页/共96页*由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。四、化学合成法制备基因片段*已知序列用DNA合成仪第50页/共96页

本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。缺点：2.

如目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，往往导致表达效率大大降低。

1.

只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段第51页/共96页第四节目的基因的载体连接--接，分子克隆的核心第52页/共96页一、PCR产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法*利用目的片段所特有的限制性内切酶识别位点对产物进行酶切分析。*在设计PCR引物时要考虑到连接方式，直接在引物的末端包含与载体相匹配的限制性内切酶位点。第53页/共96页(二）T/A克隆法

*PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中。3′5′T载体3′5′载体T3′5′3′5′AAPCR产物一、PCR产物的克隆策略第54页/共96页TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATP*不需酶切*不受酶切位点的限制第55页/共96页（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端高背景(自身环化)双向(正、反)插入单酶切缺陷二、外源DNA片段和载体的连接#58.

第56页/共96页BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶16ºC16hGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连同一限制酶切位点连接如何实现？第57页/共96页（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1

本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！第58页/共96页（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++DNA连接酶接头(linker)

本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端而进行粘端连接。

第59页/共96页（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶

+dGTP末端转移酶

+dCTP

本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点第60页/共96页第五节重组分子的扩增和鉴定第61页/共96页一、重组DNA分子导入受体细胞转宿主细胞或受体细胞：定义：被导入重组DNA分子的细胞。分类：

原核细胞：大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞要求：

※容易接纳重组DNA分子

※对载体的复制扩增无严格限制

※不存在特异的能降解外源DNA的内切酶

※不对外源DNA进行修饰第62页/共96页重组DNA分子导入方式：转化(transformation)

将重组DNA分子导入原核细胞的过程。转染（transfection)将重组DNA分子导入真核细胞的过程。感染（infection）以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入原核或真核细胞，使目的基因得以繁殖的过程。第63页/共96页转化(transformation)转化的关键：感受态细胞的制备感受态细胞（competentcell）：经理化方法处理而容易接收外源DNA分子的细胞。转化的方法：化学法（

CaCl2

法）：需感受态细胞电穿孔法：不需感受态细胞转化效率较高但需特殊仪器第64页/共96页基因导入装置

(Bio-Rad)

BTXECM2001多功能细胞融合仪第65页/共96页

转染（transfection)

分类：瞬时转染稳定转染：G418（Geneticin)方法：磷酸钙转染

DEAE葡聚糖介导转染电穿孔法

脂质体转染

显微注射第66页/共96页非转化子转化子非重组体重组体鉴定单抗生素筛选非转化子(不能生长）转化子阳性重组体自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体二、重组DNA分子的筛选、鉴定（一）抗生素筛选仅作为初步筛选第67页/共96页AmprTetr插入失活的双抗生素对照筛选法*若目的基因插入抗生素抗性基因外部，重组质粒能在含该抗生素的培养基上生长*若目的基因插入抗生素抗性基因内部，即引起插入失活，重组质粒不能在含该抗生素的培养基上生长第68页/共96页BamH

IDNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPstI目的基因与pBR322经BamH

I酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？思考题用BamH

I酶切第69页/共96页(插入失活法)

抗药性标记选择在tetr（TcR)中插入外源DNAampr插入失活的双抗生素对照筛选法第70页/共96页克隆3,5,7,9,10

是阳性克隆TetTet平板123456789101112123456789101112AmpAmp转化子非转化子(不能生长)第71页/共96页插入失活筛选法(1’20’’)第72页/共96页(三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶酶切鉴定快速小量提取质粒DNA跑得慢--重组质粒跑得快--空载体（二）X-gal筛选蓝/白筛选

见于pUC系列、pEGM系列、M13蓝色菌落：阴性克隆

白色菌落：阳性克隆

#75

第73页/共96页

α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18

第74页/共96页重组CK2β亚基转化子的筛选

第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆;第4,6,8号是阴性克隆第75页/共96页1.λDNA/EcoRI+HindⅢ2.recombinantplasmid/NdeI+HindIII3.recombinantplasmid/HindIII4.pT7-7/HindIII重组质粒的酶切鉴定第76页/共96页（四）序列分析

*通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点通用引物

*对于表达型重组子，插入片段必须是正确的序列，一般要进行DNA测序第77页/共96页ABIPRISM310型DNA测序仪主要用于DNA序列分析PE3700型DNA测序仪第78页/共96页（五）其他方法内切酶重组DNA目的基因分离电泳印迹到NC膜探针放射性非放射性分子杂交核酸分子杂交第79页/共96页覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜

裂解、变性、固定等与探针杂交放射性自显影1234563和5是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交第80页/共96页菌落印迹杂交(6’03’’)第81页/共96页SDSpurifiedrecombinanthumanCK2βsubunitandWesternblot用已知的特异抗体检测目的基因蛋白免疫化学检测（Westernblot)第82页/共96页重组DNA技术操作过程可形象归纳为：小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

第83页/共96页重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因文库

内切酶化学合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主鉴定（酶切电泳、序列分析、杂交、Westernblot等）筛选(抗生素、X-gal等法)阳性重组体第84页/共96页第六节外源基因的表达表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化

外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程

第85页/共96页一、外源