壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性研究报告

2023年度新苗人才计划项目项目名称：壳寡糖的酶法制备和分离技术的研究立项背景及意义壳寡糖(Chitooligosaccharide)，又名甲壳低聚糖，是由氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的聚合度约为2-20的低聚糖，其分子量低于5000，具有稳定的三维结构。壳寡糖可运用壳聚糖经过生物酶技术降解制得。壳聚糖广泛存在于自然界的虾壳、蟹壳和真菌中，虽然有特殊的生物活性，但由于其分子量大、水溶性差，在人体内不易被吸收而使其应用受到限制。作为一种生物技术产品，壳寡糖几乎包括了所有壳聚糖的所有优点，它具有良好的生物相容性和生物降解性、亲水性、吸附性、生物学活性等多种理化特征以及天然、高效、毒副作用少、抗药性不显著、性能多样等特点。科学研究表明，壳寡糖的功能作用和生物活性比起壳聚糖将提高数十倍、应用领域更加广泛、人体吸收率近100%（壳聚糖吸收率6.48%），而且增加了促进钙吸收的新的功能作用，具有较高的科技含量和附加值，发达国家称其为“软黄金”。壳寡糖具有三调（免疫调节、调节pH值、调节荷尔蒙）、三降（降血脂、降血糖、降血压）、三排（排胆固醇、排重金属离子、排毒素）、三抑（抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素）等功能，同时，还具有抗自由基、防辐射、抗炎、止血以及促进伤口愈合等功能。壳寡糖及其衍生产品可广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域。在医药保健领域具有提高免疫、活化细胞、调节血糖血脂血压胆固醇、预防治疗癌症、强化肝功、促进钙吸收、增殖肠道有益菌等功能；在食品饮料领域是一种良好的健康食品添加剂，可增殖乳酸菌、双歧杆菌等人体有益菌100倍以上；在日化领域具有营养皮肤、抑菌、保湿等功能，性能优于传统的透明质酸等产品；在农业领域可激活植物免疫系统和酶系活性，能促进植物生长、提高作物产量和品质、增强抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等，具有药肥双效功能，被誉为“不是农药的农药，不是化肥的化肥”，市场前景极其广阔。目前壳寡糖产品的年需求量在6000吨以上。在精细化工领域，由于壳寡糖的绿色天然的特性符合世界日化产品的发展趋势，含天然活性物质的化妆品顺应回归自然、科学美容的消费趋势，欧洲现已有60多个与壳寡糖相关的化妆品品牌，年需求壳寡糖1500吨。我国化妆品年销售额从1982年的2亿元人民币发展到2023年的400亿元，居亚洲第二位。在生物医药领域，从中国产业发展研究中心统计可知，2023年我国医药生物技术工业总产值将达到400亿-500亿元。在保健食品领域，韩国于1996年即批准壳寡糖为功能性保健食品，我国现在已有许多保健品及药品等年需求壳寡糖上百吨的保健食品生产厂家，国内许多医药保健品公司正在申报壳寡糖保健食品文号，预计年需求量将以高于30%的速度递增。在农林畜牧领域，因壳寡糖具有良好的抗病虫害功能,且有安全、微量、高效、成本低等优势，可使水果、蔬菜、粮食增产10%-30%，因而可以应用于生物农药产品，部分替代化学农药。目前我国农业病虫害共2023余种，受灾面积数10亿亩。因此壳寡糖在农林畜牧上的应用对我国的农业可持续发展具有重要意义，以壳寡糖为基础的生物农药将有广阔的发展空间。科技部已将“壳寡糖新产品的开发应用”列为国家“九五”攻关计划项目和“十五”招投标项目，要求建立数条年产500吨以上的壳寡糖生产线，到2023年总产值可达1100亿-1300亿元，从而满足国内市场的需求。壳寡糖的级别不同，售价差额较大。农业专用壳寡糖市场价为400元/公斤；食品级壳寡糖市场价为600元/公斤；而化妆品级壳寡糖市场价为150元/公斤。随着壳寡糖应用范围的不断扩大，加之作为一种性能优异的基础原料，市场需求量将呈稳步上升趋势。同时，壳寡糖作为一种中间原料，出口市场稳定。近年来，随着我省海产品加工业的发展，尤其是甲壳素综合利用产业的兴起，我省逐步成为东南亚地区海产品加工利用中心和主要的甲壳素产业发展基地。。2023年全省甲壳素制品的直接经济总产值约10亿元左右（与其相关的、间接的纺织、食品、医药、化工等行业的产值达数百亿元）。在此基础上，本项目从壳聚糖的局限性出发，着重研究了通过专一性酶法技术降解壳聚糖，制备聚合度均一的壳寡糖产品，将使产品的附加值得到大幅度地提升。因此，本项目的实施，对于有效利用甲壳素资源，促进我省甲壳素行业健康发展，意义重大。由于项目原料来源方便、价格低廉，将大大降低了加工企业的生产成本，满足了市场紧缺，且安全无公害，推广应用前景广阔，对全国的水产加工业发展具有重要影响。国内外研究现状与发展趋势开发应用壳寡糖是甲壳质行业的制高点，也是当今生物制药技术的一个亮点。目前，其科研开发主要集中在日本、韩国等国家。壳寡糖的主要制备方法有化学法、物理法和生物法。化学法主要包括酸水解法、氧化法、超临界流体法、配位降解法等。目前，国内对H2O2氧化降解法研究较多，可在降解过程中伴随的副反应还需要探索出有效的遏止方法，另外必须注意氧化降解对产品活性的影响以及存在残留的H2O2对食品安全性是否产生隐患也是值得考虑。物理法包括微波法、超声波法、光降解法、γ射线法等。生物法主要有酶法降解、反应器和酶降解、糖基转移法等。其中已用于工业化生产的有酸水解法、氧化降解法,但是存在产品相对分子质量分布较宽,均一性差，分离纯化难度高以及污染严重等问题；物理方法也有一定的缺点,不能作为主体方法用于壳寡糖的制备；酶降解法条件温和,产物不用脱盐，工艺易于控制,易于得到所需聚合度的壳寡糖,并且对环境不产生污染，是较理想的制备方法，特别是酶降解和反应器联合方法,已经在产业化道路上迈出第一步，但在制备工艺上还有许多有待改进提高产量的地方。20世纪90年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。我国对该产品的研究虽起步较晚，但近年来做了大量的工作，并趋于活跃。2023年8月，山力、济南海得贝公司利用复合酶法制备壳寡糖的生产线正式投产，壳寡糖在我国第一次实现了产业化生产。复合酶比起专一性酶制备壳寡糖，所得降解产物相对分子量分布不容易控制，聚合度不够均一。但因为目前市场上专一性酶价格昂贵，如何寻找到降解效果好、成本又不高的专一性酶，是一个急需解决的技术难题。而这一技术难题的解决无疑将为我国整个甲壳素行业的发展提供帮助。三、项目主要研究开发内容、技术关键以及科研创新的主要方式（一）主要研究内容：1、专一性酶菌种的筛选。通过制作以壳聚糖为唯一碳源的平板筛选分离培养基进行筛选。

采用平板划线分离法接种，放入30℃2、产酶菌种的发酵培养。根据已优化的发酵培养条件进行发酵培养，对发酵上清液中粗酶，采用75%饱和度乙醇沉淀，获得粗酶粉，测定酶活力，低温保存。3、壳寡糖的酶法制备和性质研究通过还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率变化测定以及酶解产物的TLC、HPLC分析，研究壳聚糖酶降解壳聚糖过程中壳聚糖脱乙酰化度、壳聚糖浓度、酶用量、反应时间和pH值对酶促反应速率和产物聚合度的影响。4、研究壳寡糖的分离技术、纯化工艺；超滤/离子交换树脂5、壳寡糖的含量检测方法研究；采用高效液相色谱法(HPLC)、测定低聚糖类的含量。6、壳寡糖产品质量标准的制定。（二）关键技术：1、高活力壳聚糖酶制剂的制备以及壳聚糖酶酶活的测定；2、壳寡糖的酶法制备技术；3、壳寡糖的分离技术；4、壳寡糖制品分析检验技术，包括还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率变化的测定；壳寡糖的含量和纯度、相对分子质量、杂质含量的测定；壳寡糖水溶性、水分的测定以及酶解产物的TLC、HPLC分析。（三）创新的主要方式：1、壳寡糖产品加工采用酶法工艺，克服了传统化学法分子量分布范围宽、易变色的缺点，且不会带来环境污染问题2、为壳聚糖的高值化利用提供了新途径。四、项目预期目标（一）主要技术经济指标1、目标：（1）以壳聚糖为原料，采用酶法的技术有效地制备、分离壳寡糖；（2）提供完整的加工技术研究报告，包括提取工艺、分离技术、产品质量研究、操作技术流程等。2、壳寡糖产品技术指标（1）水分含量

<7%

（105℃（2）分子量为500-5000Da（Waters600E检测）；（3）不溶物≤1.0％；（4）粘度（5％）≤10mPaS；（5）pH4-6

；（6）脱乙酰度≥70％；（7）六、七、八糖含量达到50%以上；（8）分散度小于1.5；3、经济指标（1）发表相关学术论文1篇；（2）提供符合质量标准的样品。（二）应用或产业化前景壳寡糖在食品加工中可用壳寡糖做填充剂、增色剂、脱色剂、稳定剂和保鲜包状膜。壳寡糖的应用范围在不断扩大，受到了国家的高度重视。目前市场上壳寡糖价格比较高，一直处于求大于供的现象。如何有效地解决这一问题，就需要研究和探索可行的方法来制备壳寡糖。酶法生产壳寡糖项目，将有利促进了我国壳寡糖行业的发展。与其它降解法相比，酶降解法具有反应条件温和，降解过程及降解产物相对分子量分布容易控制，制备的低聚糖生物活性高，产物不用除盐。过程容易控制，且不对环境造成污染等优势，是理想的壳寡糖生产方法。本项目的制备方法解决了产品的安全性问题，减少资源浪费，满足市场要求，应用前景广阔。但低聚壳聚糖的制备，尤其是聚合度6-8壳寡糖的制备大都处于实验室的研究阶段。因此，本项目拟在实验室研究的基础上，通过专一性酶法制备壳寡糖，进一步发展成产业化，以满足国内外对壳寡糖的需求。五、项目实施方案（一）技术路线1、采用专一性酶解法进行制备壳寡糖；2、壳寡糖的分离，纯化精制技术研究采用水解产物薄层层析(TLC)分析、水解产物(HPLC)分析。3、提取率及品质分析采用数理统计的方法来分析提取率的高低，此外，采用相应的方法进行质量、水溶性、水分的检测。4、技术流程筛选菌种，筛选菌种，菌种扩大培养。碳源、氮源、pH碳源、氮源、pH温度、培养时间高活力壳聚糖酶制剂的制备高活力壳聚糖酶制剂的制备壳聚糖的脱乙酰度壳聚糖的分子量壳寡糖的壳聚糖的脱乙酰度壳聚糖的分子量壳寡糖的酶解壳寡糖的分离壳寡糖的分离壳寡糖样品分析与检验壳寡糖样品分析与检验（二）组织方式以组员分工合作的形式来负责完成此项课题（三）课题分解（1）菌种的筛选；（2）产酶菌种的发酵培养；（3）壳寡糖的酶法制备和性质研究；六、计划进度安排日期工作进度2023年7月至2023年1月筛选产专一性壳寡糖酶的菌种并对菌种进行扩大培养的技术。壳寡糖的酶法制备，以及壳寡糖的分离、纯化技术。2023年2月至2023年3月壳寡糖产品分析与检验。2023年4月至2023年6月进一步完善并优化生产技术，完成项目总结，准备项目鉴定。七、现有工作基础与条件实验室具备实验所需的设备：TGL-16C台式离心机上海安亭科学仪器厂电热恒温水浴锅江苏金坛县国华仪器厂XW-80A漩涡混合器上海医科大学仪器厂隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械仪器一厂HYG-A型回转恒温调速摇瓶柜江苏太仓市实验设备厂手提式灭菌锅无锡市第二医疗器械厂超净台苏州净化设备厂磁力搅拌器江苏江阴科研器械厂WFZ-W2100紫外/可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器W1100紫外分光光度计北京瑞利分析仪器公司MettlerToledo320-5pH计上海梅特勒乌氏粘度计八、经费预算省级科技计划项目经费预算表项目名称：金额单位：万元序号预算科目名称合计省财政拨款经费地方部门配套经费自筹经费11、设备费2（1）购置设备费3（2）试制设备费4（3）设备租赁费52、材料费0.363、测试化验加工费0.1574、燃料动力费85、差旅费0.196、会议费0.05107、合作、协作研究与交流费118、出版/文献/信息传播/知识产权事务费0.15129、人员劳务费0.051310、专家咨询费1411、管理费1512、其他开支16经费总计0.8

一、工程概况忠县白石镇两河片区供水工程建设规模1000m3/d规模水厂一座，水源为红旗水库，经辽阴岩净水厂常规工艺处理后，用配水管道向用户供水。该项目位于白石镇华山村，主要项目有反应沉淀池、重力式无阀滤池、清水池、加氯加药房、管理用房、减压池、配水管、围墙、进场道路及厂区道路、PE100（160、140、125、110、90、75、63、50、40、32）管道约40公里等。主要解决白石镇白花村、关金村、华山村、望岩村、中坪村5个村5617人的饮水安全问题。1、建设四方建设单位：忠县水务服务中心设计单位：重庆布泽水利电力勘测设计有限公司监理单位：北京市中冠水利工程监理有限公司重庆分公司施工单位：四川山江建工集团有限公司二、工期工期：合同工期为：20**年**月**日到20**年**月**日。实际工期20**年**月**日到20**年**月**日。在建设单位的正确部署下，组织措施落实到位，以各行政村为单元，切实做好政策处理，组织平行流水施工，使得各项工作开展顺利，按时完成了本工程的施工任务。三、主要施工方法一、PE100管施工施工准备（1）施工技术人员认真熟悉图纸，领会设计意图，对图纸中发现的问题及时与业主、监理及设计人员联系。熟悉PE100管的一般性能，掌握必须的操作要点。（2）在各项预制加工项目开始前，根据设计施工图编制材料计划，将需要的材料、设备等按规格、型号准备好，运至现场。（3）材料设备要求：管材和管件的内外壁应光滑平整，无气泡、裂纹、脱皮和明显的痕纹、凹陷，色泽应基本一致。管材的端面应垂直于管材的轴线。管件应完整、无缺损、无变形。到现场的管材、管件等自检合格后并经监理、业主验明材质，核对质保书，规格、型号等，合格后方能入库，并分别作好标识。（4）材料的保存：管件和管材不应长期置于阳光下照射，为避免管子在储运时弯曲，堆放在平整的地方且堆置高度不得超过1.5米，管件逐层堆码。搬运管材和管件时，应小心轻放，避免油污，严禁剧烈撞击，与尖锐触碰和抛、摔、拖。施工现场与材料存放处温差较大时，于安装前将管件和管材在现场放置一定时间，使其温度接近施工现场环境温度。施工条件(1)施工图纸及其他技术文件齐全,进行图纸技术交底,满足施工要求。(2)施工方案、施工技术、材料机具供应等能保证正常施工。(3)施工现场满足管道施工的条件。管道裁剪及连接1、管道的裁剪切割管材须端面垂直于管轴线，切割时使用管剪或管道切割机，必要时用锋利的钢锯，对其断面去除毛边和毛刺。管径较小（De20～De40）时用管剪比较方便，管径较大时用管道切割机或钢锯裁剪管道，在裁剪前应在裁剪的位置画好印记，确保管材端面垂直于管轴线。2、管道的连接（1）同种材质的给水聚丙烯管及管配件之间安装可采用热熔连接或电熔连接，安装应使用专用热熔或热熔工具。暗敷在地坪面内的管道不得采用丝扣或法兰连接。（2）管道一般热熔连接，以下介绍热熔连接的步骤：1）接通热熔以电源，到达工作温度指示灯亮后开始操作；2）为防止可能出现的细小裂纹和管道的损伤，在操作前，将管材两端各切下4-5厘米，以去掉受损的端口。再擦拭管材与管件的端面保证清洁、干燥、无油；试压及冲洗消毒1、试压所有的安装管网都要排空并进行压力试验。冷水管试验压力应为管道系统工作压力的1.5倍，但不得小于1.6MPa；（1）试验的准备水压试验时间应在热熔管道连接24小时后进行，在管道安装完毕之后而尚未隐封起来之前，要先向管路内通水并排出气体。如果可能的话，要把压力泵按放在系统的最低处。采用能够读出变化值为0.01MPa压力的压力表，压力表要安装在被试管网的最低点。（2）试验增大压力到规定的试验压力值。一小时之后开始试验。在这个时期虽然有压力损失，也不能增大压力。试验压力变化要小于或等于0.05MPa。在工作压力的1.15倍状态下，稳压2小时，压力降不得超过0.03MPa，同时检查各连接处不得渗漏。对试压管道应采取安全有效的固定保护措施,但接头部位必须明露。此项试验在各末端开口处用管帽封堵,所有配水器具、水表均不安装。为了能正确地辨别隐蔽管道的真实位置,隐蔽后的管道应在地面用红色油漆标识管道位置,防止在土建和其他工种施工过程中破坏管道。（3）管道通水及冲洗消毒（1）管道通水水压试验全部合格后,在供水设备具备供水条件,减压装置已调至规定的数值,各用户末端的配水器具安装完毕,室内外排水系统和设施均具备使用条件的情况下,可进行全系统通水试验。其目的在于检验供水系统的供水能力、水压是否满足设计和规范规定。（2）管道冲洗消毒给水管道系统在验收前应进行通水冲洗。冲洗水流速宜>2m/s,冲洗时应不流死角,每个配水点龙头都应打开,在系统最低点设放水口,直至冲洗出口处排水水质与进水相当为止。管道冲洗完在使用前应采用游离氯浓度为20～30mg/L的水灌满管道进行消毒,含氯水在管中应静置24h以上。管道消毒后，用饮用水冲洗，并经卫生监督管理部门取样检验，水质符合现行的国家标准《生活饮用水卫生标准》后，方可交付使用。材料的节约1、管件的合理使用由于PE管配件的价格比较昂贵，在管道安装中尽量减少管配件的使用，尤其是管径较大的干立管更应注意管件的合理使用质量控制措施在施工前,先进行包括工程特点、设计要求及本工艺规定内容的施工技术交底。增强施工人员的质量意识,调集责任心强、经验丰富的人员参与施工。设立专职质检员进行过程控制。保管好各类施工机具,特别是要保证热熔焊接机处于良好的工作状态。设置严密的质量控制体系,实行分级控制,每道工序都要进行检查,合格后方可进入下道工序。一、沟槽开挖（1）沟槽开挖前工作开槽前要认真调查了解地上地下障碍物，以便开槽时采取妥善加固保护措施，根据业主方提供的地下管线资料和我公司的现场调查，统计出现况地下管线情况，采取有效措施加以保护。（2）沟槽开挖形式根据设计图中设计管道的规格及埋置深度以及规范要求来确定沟槽开挖的形式。（3）开挖方法a.土方开挖采用机械开挖，槽底预留20cm由人工清底。开挖过程中严禁超挖，以防扰动地基。对于有地下障碍物的地段由人工开挖，严禁破坏。b.沟槽开挖尽量按先深后浅顺序进行，以利排水。c.挖槽土方处置，按现场暂存、场外暂存、外弃相结合的原则进行。开槽土方凡适宜回填的土选择妥善位置进行堆放，但不得覆盖测量等标注，均暂存于现场用于沟槽回填。回填土施工前制定合理土方调配计划，作好土方平衡少土方外运及现场土方调运。d.开槽后及时约请各有关人员验槽，槽底合格后方可进行下道工序。如遇槽底土基不符合设计要求，及时与设计、监理单位及地勘部门联系，共同研究基底处理措施，方可进行下道工序。二、下管在沟槽检底后，经核对管节、管件位置无误后立即下管。下管时注意承口方向保持与管道安装方向一致，同时在各接口处掏挖工作坑，工作坑大小为方便管道撞口安装为宜。七、检查第一节管与第二节管安装要准确，管子承口朝来水方向。安完第一节管后，用钢丝绳和手板葫芦将它锁住，以防止脱口。安装后，检查插口推入承口的位置是否符合要求，用探尺插入承插口间隙中检查胶圈位置是否正确，并检查胶圈是否撞匀。八、安装注意事项（1）管子需要截短时，插口端加工成坡口形状，割管必须用球墨铸铁管专用切割机，严禁采用气焊。（2）上胶圈之前注意，不能把润滑剂刷在承口内表面，不然会导致接口失败。十、沟槽回填（1）水压试验前，除接口处管道回填至管顶50cm以上（2）管道两侧回填高差不超过20cm。（3）回填分层进行。管道两侧和管顶以上50cm用木夯夯实，每层虚铺厚度不大于20cm；管顶以上50cm至地面用蛙式打夯机夯实，每层虚铺厚度20-25cm；应做到夯夯相连，一夯压半夯。（4）分段回填时，相邻两段接茬呈阶梯形。（5）回填土不得有石块、房渣土等不能夯实的土质。十一、水压试验（1）进行水压实验应统一指挥，明确分工，对后背、支墩、接口、排气阀等都应规定专人负责检查，并明确规定发现问题时的联络信号。（2）管道接口完成后，用短管甲、短管乙及盲板将试压管段两端及三通处封闭，试压管段除接口外填土至管顶以上50cm并夯实。做好后背及闸门、三通等管件加固。由低点进水，高点排气，注满水后浸泡24小时后，在试验压力下10min降压不大于0.05Mpa时，为合格。（3）水压实验应逐步升压，.每次升压以0.2Mpa为宜，每次升压以后，稳压检查没有问题时再继续升压。（4）水压实验时，后背、支撑、管端等附近不得站人，检查应在停止升压时进行。五、工程质量（一）质量目标及保证体系本标工程施工质量目标是“合格”等级，在监理工程师和本公司的监督下开展工作。项目经理为质量总负责，全面负责施工质量的控制，施工员、质检员、施工班组长、测量员按质量体系程序文件要求，各自做好本职工作。（二）质量保证措施1、遵循“信誉至上、质量第一”的宗旨。严格按设计和施工图纸标准精心组织施工，并接受业主和监理工程师对施工质量的检查与监督。2、加强对职工、民工的质量意识教育，牢固树立“质量第一”的观念，发扬创优传统，做好技术措施交底工作，层层落实质量管理岗位责任制。3、推行全面质量管理，强化质量保证体系，工地内设置质检组和试验组，实行专职质量管理，对工程的每个部位、每个工序都实行严格控制。4、层层落实工程质量责任制，每道工序都严格实行“三检制”，使“初检、复检、终检”责任落实到人：“初检”由施工班长负责，“复检”由项目质量员负责，“终检”由公司质安科人员负责。坚持工前有交底，工中有检查，工后有验收的一条龙操作管理办法。每道工序在完工后，须经监理机构抽检并签证合格后方可进行下道工序施工。密切配合监理机构对工程质量的检查和监督，听从监理工程师的指示。发现问题及时落实纠正。5、建立质