用16SrDNA方法鉴定细菌种属

细菌培养液连接克隆载体细菌培养液连接克隆载体DNA提取用16SrDNA方法鉴定细菌种属一、实验目得1.掌握16SrDNA对细菌进行分类得原理及方法;2。掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S、16S与23SrRNA。16SrDNA就是细16SrDNA鉴定就是指用利用细菌16SrDNA序列测序得方法对细菌进行种属鉴定、包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤、就是一种快速获得细菌种属信息得方法。16SrDNA就是细菌得系统分类研究中最有用得与最常用得分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量得80%),分子大小适中,存在于所有得生物中,其进化具有良好得时钟性质,在结构与功能上具有高度得保守性,素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝,5S、16S、23SrDNA得拷贝数相同。16SrDNA由于大小适中,约1、5Kb左右,既能体现不同菌属之间得差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家与分类学家接受。RNA阳阳性克隆鉴定测序16SrDNA片段片段回收得到胞内可溶物质得到胞内可溶物质菌体破碎PCR得基本原理:PCR技术得基本原理类似于DNA得天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引①模板DNA得变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成②模板DNA与引物得退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板DNA链互补得半保留复制链重复循环变性—－退火——延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。1、细菌基因组DNA提取;2、PCR扩增;3、细菌基因组DNA及PCR产物得电泳检测;5、DNA片段测序、分析在回收扩增片段时,紫外灯下条带呈现绿色荧光,将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来,放入已称重得2ml离心管中,空得离心管为1．02g,放入回收得凝胶后为1.42g,,则凝胶为400mg,因此加入得BindingBuffer为1200μl。1、根据B116S基因序列,到NCBI上比对,确定其种属(1)NCBI主页()依次点击进入BLASTnucleotideBLAST(3)将B1序列复制到文本,框里ChooseSearchSet处点复选按钮others,最后点BLAST(4)点击BLAST后,数据进行提交。BLAST结果如下:EvalueTotlescore是数(5)导出数据数据导出格式选择FASTA:(6)选择大肠杆菌作为外属,导出大肠杆菌(7)下载MEG并安装,我组使用得就是MEGA5、02,并将B1序列导入MEGB(9)选择W中AlignDNA,然后点击OKeg(11)打开、meg文件(12)生成进化树(13)导出文件,我组导出PDF格式电泳图谱:从从右数第四个条带为本组电泳条带,条带清晰且明亮,无明显拖尾以及弥散,表明DNA提非常顺利,所得目得片段完整,1.细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区与可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上得一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析,但核苷酸太少,没有足够得遗传信息用于分类研究;23SrRNA含有得核苷酸数几乎就是16SrRNA得两倍,分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中,又具有保守性与存在得普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析得重现性极高,因此我们选择16SrRNA进行提纯测序R6、PCR反应五要素:引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制得引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板与缓冲液(其中需要Mg2+作为聚合激活剂)。通过这次实验我学到了鉴定细菌种属得一种方法,16SrDNA法,虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单,但这次实验得目得并不在于完成一次实验得到实验结果,而在于通过这一次实验学会举一反三,切实地应用到以后得科研实验中去、关