创新实验顺铂和阿霉素的浓度对细胞增殖产生的影响

/创新实验论文探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响姓名：胡尔曼那力·艾力胡加学号：２年级：20１1级专业：生物科学探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响摘要:本实验主要探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素对HeLa细胞增殖及凋亡的影响，HeLａ细胞是一种癌细胞，增殖速度快，通过探究其药物的浓度对癌细胞的抑制及其凋亡情况,可以利用药物有效地控制细胞的增殖并使细胞致死.通过ＭTT比色法对HeLａ细胞进行生长曲线的测定，观察细胞的生长情况。在生长曲线上找出相应的IＣ５０的值，并且比较不同浓度下的IＣ50的值，即可知道药物的浓度对细胞增殖所造成的影响。通过流式细胞术实验方法测出细胞的凋亡比例及各个周期时相的百分比即可知道不同药物对于ＨeLａ细胞凋亡的影响。前言：细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以细胞分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去.可见,细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞如果增殖异常如无限地增殖,将会导致生物体的正常生命功能受阻，如肿瘤的发生。细胞死亡也是生物体的重要生命活动之一。多细胞生物发育过程中，在细胞增殖和分化的同时一些细胞被选择性地消除,以形成组织、器官和四肢，而且在整个生命进程中,细胞的死亡与新细胞的产生之间的动态平衡对于维持组织和器官的正常功能具有重要作用.因此，细胞死亡调控的异常与帕金森症、自身免疫性疾和癌症等疾病的发生和发展密切相关。癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一,并呈不断上升趋势。目前用于癌症治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗.肿瘤化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。不同肿瘤的化疗效果差别很大，手术前后的合理化疗，有助于提高疗效。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用.其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小.如顺铂、阿霉素、喜树碱、顺铂、阿糖胞苷、放线菌酮、环磷酰胺.这些药物均可以抑制肿瘤细胞的增殖,并且目前有不错的效果。关键词：顺铂阿霉素ＨｅＬａ细胞细胞增殖细胞凋亡1实验原理1．1HeLａ细胞HeＬa细胞是源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。HｅLa细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒（HumanＰapｉlｌomaviruｓ18或HPＶ1８）转型成癌细胞的HeLa细胞至今已被视为“不死的”，也就是说此细胞株（不同于其他人类细胞)不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已培养出一个不间断的系列.从１9５1年至今，ＨeＬa细胞已经培养了５0多年，分裂了1８０0０次以上仍然没有停止的迹象。此细胞株即使和其他癌细胞相比，增殖依然异常迅速.１．2顺铂和阿霉素顺铂（顺氯氨铂，cisｐlatｉn,DDP)将所含之氯解离,然后与ＤＮA上的核碱鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成ＤNA单链内两点的交叉联结，也可能形成双链间的交叉联结，从而破坏DNA的结构和功能.对RＮA和蛋白质合品属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性,可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构,有较强的广谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效.成的抑制作用较弱.属周期非特异性药物。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来杀灭癌细胞。盐酸阿霉素对机体产生广泛的生物化学效应。具有强烈的细胞毒性作用.其作用机制主要是阿霉分子嵌入ＤNA而抑制核酸的合成.1.3PI和Ho．３334２ＰI(碘化丙啶）：双链核酸标记物,亲水性，不能通过完整细胞膜,激发光谱和发射光谱分别为535nm和61７ｎm,激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可作为激发光。Hｏ．3３342:特异结合ＡＴ区的DNA标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别为350ｎｍ和461ｎm细胞类型膜完整性染色质凝集程度凋亡小体的形成ＰI染色Ｈｏ。333４2正常细胞完整不凝集无无法透过蓝色凋亡细胞完整高度凝集有无法透过蓝色坏死细胞破损一定程度的凝集无橘红色蓝色(同时染PI被橘红色遮掩）1．４MTT比色法MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MＴT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Foｒmazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜(ＤMＳＯ）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490ｎm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。1．5ＩC50IC50是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应，抗原抗体反应等。在凋亡方面,可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡5０％，该浓度称为50％抑制浓度,即凋亡细胞与全部细胞数之比等于５0％时所对应的浓度,IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。２．实验步骤2.1利用ＭＴＴ法检测细胞增殖1、取对数生长期的细胞，用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为４x１04/mL，取细胞接种到96孔板,每孔200μL，80０0细胞／孔。2、加药处理：（1）２4小时后，待细胞贴壁后吸取培养基2００μL，弃除,调零孔不作处理。（2）设置药物浓度分别为1x１0－3μg/μL、2ｘ10-３μg／μＬ、4x10－3μg/μL、6ｘ10-3μg／μL、8ｘ10-3μｇ/μL，对应按每列分别加入Cｃ1、C2、Ｃ4、C6、Ｃ8（顺铂组），Cd１、D2、D4、Ｄ6、D8（阿霉素组）列中。96孔板上药物分布如表１所示：（３)配置浓度梯度及加药方法：药物母液浓度为5mｇ/mL,即5μg/μL，顺铂溶于DMSO，盐酸阿霉素溶于水。分别取0．4ｍL顺铂/阿霉素,加入1.６mLＤMSO／水,混合均匀,得到1μg/μL的顺铂及阿霉素溶液.顺铂与阿霉素的浓度梯度配置方法相同。取药物2/4／8/12/1６μL，对应加入1４/１2/8／4／0μＬＤMSO/水（药物为顺铂即加DＭSO，药物为阿霉素即加水）,各加入２mL培养基,即配制出浓度分别为为1x10^－3μg／μL、2x1０^－3μg／μL、４x10^—3μg／μL、6ｘ１0＾－3μg/μL、8x10^-3μg/μL的药物。两种药物不同浓度分别相应加入Cc1、Ｃ２、C4、C6、C8（顺铂组)，Cd１、D2、Ｄ４、D6、D8（阿霉素组)列中,每孔200μL。取培养基2mL，分别加入16μLＤＭSＯ／水，混合均匀,加入到对照１/对照２列中，每孔200μL。3、测定:取测定孔，弃去培养基,加１0０μL新鲜的培养基，加１２μLMＴT,4小时后加１00μL裂解液。过夜后,用酶标仪测定OD值。4、根据测得ＯD值，用SＰＳＳ软件进行分析,求出以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度IC50，即半数抑制浓度。2.2细胞的形态学观察1、取生长到８0—9０％融汇度,对数生长期的细胞,按1:4比例传代.取1瓶细胞传到4瓶。2、按求得的顺铂及阿霉素浓度在传代的第二天，向培养基中加入药物或对照溶液。弃除细胞培养瓶中原培养液，加入5mL新培养基。分别取浓度为5ｍg／mL的顺铂及阿霉素母液，其中顺铂7μＬ，阿霉素4μL各加入细胞培养瓶中。对照组分别取DMSＯ７μL,水μL各加入细胞培养瓶中。3、48—７2小时后，收集培养液,用胰酶适度消化细胞，用收集的培液吹打细胞,将分散成单个的细胞悬液收集至10mＬ离心管中，１０00ｒpｍ,离心15mｉn去上清,用0．2毫升PBS重悬细胞4、取2０0μlPBS细胞悬液，加入PＩ20μＬ（终浓度100μg/ml)，Ho。３33422μL（终浓度10μg/ml)，混匀,37度温箱中避光标记１5ｍin。（带手套操作)5、1000ｒpm,离心10min，弃上清,加10-50μLPＢS重悬，取１0μL滴于载玻片上,盖片（不能有气泡或漂起)，保存于暗处.6、荧光显微镜观察拍照（紫外激发)。３.实验结果３。１ＭTT法实验结果顺铂的实验结果:分析：由MTＴ实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算IC50时应将这些数据舍去。根据所测OD值可算出顺铂对BGC—823细胞的IC50值为5。６９8左右。但数值波动较大,实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为7。阿霉素的实验结果分析:由MＴT实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算IC50时应将这些数据舍去。根据所测OＤ值可算出顺铂对BGC-823细胞的ＩC50值为３．054左右。但数值波动较大，实验结果不稳定,综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为4。3。2顺铂和阿霉素对人宫颈癌细胞ＨeLa细胞凋亡的影响的形态学观察图一为Hｏ.3３34２2和PI染料双染HｅLa细胞得到的细胞核形态图。从图中观察可以看到有呈蓝色的细胞，也有呈红色的细胞。图一中的A、B代表未加顺铂和阿霉素的空白对照。Ｃ为加入顺铂的HeＬａ细胞的细胞核形态图，D为加入阿霉素的HｅLa细胞的细胞核形态图。ＡBCD图一Ho。3334２2-PI双染观察凋亡细胞的形态从图一中可以看出，对照组A、Ｂ的细胞数目要明显多于实验组Ｃ、Ｄ的细胞数目。C、D实验组加入了顺铂和阿霉素,由此说明顺铂和阿霉素确实对于细胞的生长具有抑制作用。当比较A、C两组的时候发现,对照组基本上没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加药组出现了部分凋亡细胞。从细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中的坏死细胞较多,可能因为实验操作不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。当BＤ两组相比较可发现对照组基本上没有出现凋亡细胞;分别观察两个视野可以发现,加药组出现了部分凋亡细胞(一个视野中有４个,另一个视野中有2个）。从细胞凋亡形态观察结果可看到,视野中有少量坏死细胞，可能因为实验操作不够轻柔,从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。有上述的比较还可以知道,顺铂和阿霉素可以促进细胞的凋亡。4．实验总结综合上面所述的三个结果分析，顺铂和阿霉素都对HｅLa细胞的增殖具有一定的抑制作用。5．