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文档简介

数字PCR技术主讲人:XXX数字PCR技术（DigitalPCR）01DigitalPCR-技术原理02DigitalPCR-发展历史03DigitalPCR-应用前景DigitalPCR-技术原理01DigitalPCR-技术原理什么是DigitalPCR？本质上是把弱信号从噪音信号中“拎”出来PCR扩增和荧光信号分析。DigitalPCR-技术原理PCR扩增阶段:1.稀释样品到单分子水平。2.平均分配进行反应。有记为1（必包含拷贝）无记为0荧光信号扩增结束数字PCR与qPCR实时荧光测定方法不同：DigitalPCR-技术原理qPCR每个循环进行实时荧光测定。样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同。低拷贝数的目标DNA分子不能通过扩增检测到。qPCR主要依赖校准物制备标准曲线进而确定未知样品的浓度，是相对定量的方法。dPCR扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。直接计数目标分子数不依靠任何校准物或外标。单DNA模板出现在反应室未被检出可能性非常低。通过计数单个分子从而实现绝对定量。DigitalPCR优点DigitalPCR-应用前景02DigitalPCR应用产前诊断1997年卢煜明教授课题组发现孕妇血浆中的胎儿游离核酸(DNA和RNA)检测开启了无创产前诊断的新领域,补充了唐氏综合症(非侵入性染色体异倍体)产前诊断方法。检测孕妇血液中完全来自胎儿的PLAC4mRNA上的SNP位点(rs8130833)的比例(digital-RNA-SNP法)，以及检测血液中21号染色体与1号染色体的相对含量(digitalRCD法)，可检测血液中25%的胎儿基因。DigitalPCR应用二代测序下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)需通过测序校正分子数量，文库制备需要微克级的样本核酸，对样本量要求较高。dPCR实现了测序文库的绝对定量，消除了构建和PCR定量标准曲线等不确定因素，相对标准偏差低于10%，在无滴定情况下，足够满足直接测序的精度要求。DigitalPCR应用0103肿瘤早期研究dPCR在EGFＲ突变患者中有30%－50%。dPCR还应用于通过其他体液，以非侵入性方式诊断肿瘤。检测稀有突变02痰液检测EGFR可代替某些病人的活检与血液中检出率相似DigitalPCR应用环境微生物方向快速诊断细菌dPCR灵敏度更高不经细菌培养就可直接鉴定

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