生物化学与分子生物学：02-第一章 蛋白质的结构与功能

第一章蛋白质的结构与功能(StructureandFunctionofProtein)一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学功能(一)蛋白质在生物体内的分布特征1.分布广所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。2.含量高蛋白质占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。3.种类多人体中蛋白质种类达十万余种，每种蛋白质都有其特定的结构与功能。1.作为生物催化剂（酶）2.代谢调节作用3.免疫保护作用4.物质的转运和存储5.运动与支持作用6.参与细胞间信息传递7.氧化供能(二)蛋白质的生物学功能具有催化功能的蛋白质免疫球蛋白如肌动蛋白、肌球蛋白第一节蛋白质的分子组成(TheMolecularComponentofProtein)一、蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。(一)组成蛋白质的元素各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%(二)蛋白质元素组成的特点二、蛋白质的基本单位——氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的编码氨基酸仅有20种，且都有特异的遗传密码编码。(一)氨基酸的通式R代表氨基酸侧链氨基酸的结构通式可用下式表示：H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R-C+NH3COOH

各种氨基酸的结构区别在于侧链（R基团）的不同，故具有不同的理化性质。

1.组成蛋白质的氨基酸都是α-氨基酸（脯氨酸为α-亚氨基酸）。α-碳原子，即与-COOH相邻碳原子。氨基均连在α-碳原子上，故为α-氨基酸。

2.组成人体蛋白质的氨基酸都是

L型，即L-α-氨基酸。不同的氨基酸其侧链不同，除甘氨酸外，其余氨基酸的α-碳原子分别连接4个不同原子或基团，是手性碳原子，有两种不同的构型，即L型和D型。（二）氨基酸的分类根据R侧链基团的结构和性质的不同，可将20种氨基酸分为5类：

1.非极性疏水性氨基酸

2.极性中性氨基酸

3.芳香族氨基酸

4.酸性氨基酸

5.碱性氨基酸

1.非极性疏水氨基酸

侧链为烃基、吲哚环、甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度小于极性中性氨基酸。

2.极性中性氨基酸

侧链为羟基、巯基、或酰氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不电离的氨基酸。3.芳香族氨基酸侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸。有苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。TrpTyr

4.酸性氨基酸

侧链上有羧基，在水溶液中能释放出H+而带负电荷的氨基酸。有谷氨酸、天冬氨酸。

5.碱性氨基酸

侧链上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能结合H+而带正电荷的氨基酸。有赖氨酸、精氨酸和组氨酸等。1.含硫氨基酸：半胱氨酸、甲硫氨酸半胱氨酸

+-HH-CH-CH-NHHOOC-CH-CH2-SHNH2HS--COOHCH-CH2NH2半胱氨酸

二硫键-CH-CH-NHHOOC-CH-CH2-SNH2S--COOHCH-CH2NH2胱氨酸(三)几种特殊氨基酸3.芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸CH2CHCOOHNHCH2CH22.亚氨基酸：脯氨酸脯氨酸4.酸性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸5.碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸（一）氨基酸具有两性解离的性质氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectricpoint，pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。三、氨基酸的理化性质pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子CHNHCOOHRCHNH2COOHRCHNHCOORCHNH2COO-RCHNHCOORCHNH3COO-R+CHNHCOOHRCHNH3COOHR+（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收240250260270280290300310光密度色氨酸酪氨酸波长(nm)（三）茚三酮反应

氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，可用作定性分析；其最大吸收峰在570nm处，由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，可作为氨基酸定量分析。四、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式

(一)肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。肽键甘氨酸+HNH2CHCOOHHNHCHCOOHH甘氨酸-HOH甘氨酰甘氨酸HNH2CHCOHNHCHCOOH1.肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。2.两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……(二)肽(peptide)3.由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽。

4.肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。5.多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。分别有：N末端：多肽链中有自由氨基的一端，C末端：多肽链中有自由羧基的一端。

多肽链的书写方向：N末端C末端。+H3NLysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArg110GlnHisMetAspSerSerThrSerAlaAlaSerSerTyrSerAsnCysAsnGlnLeuArgProValLeuValAsnArg30GlnHisMetAspGlnValThrSerAlaAlaSerAsnThrSerAsnCysAsn20MetLysLysLys40ThrValGlu50AspGlnCysCysCysCys60LysAlaCysCysLysAsnGluThrGlnThr70ThrSerTyrSerAspThrIleSerMet80SerArgGlySerGluThr90AsnProLysTyrTyrLysThrAlaThr100LysIleGlnHisAlaAsnAlaIleValAlaAspPheHisValProValTyrProAsnGlyGlu110120ValSerCOON末端C末端牛核糖核酸酶124(三)几种生物活性肽

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)COOHH-C-NH2CH2H2CH2CCONHCHCH2SHCONHCOOH谷氨酸半胱氨酸甘氨酸GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH与GSSG间的转换谷胱甘肽有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）体内重要的还原剂，对机体起到保护作用生物学功能：与致癌剂、药物等结合，保护机体免受毒物侵害体内许多激素属寡肽或多肽。2.多肽类激素(TheMolecularStructureofProtein)第二节蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构包括：一级结构(primarystructure)

二级结构(secondarystructure)

三级结构(tertiarystructure)

四级结构(quaternarystructure)空间结构1.定义

蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构2.主要的化学键

肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。二、蛋白质的二级结构1.定义

蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。

2.主要的化学键

氢键

(一)定义与主要化学键(二)肽平面／酰胺平面：形成二级结构的基础肽键键长0.132nm，介于单键（0.149nm）和双键(0.127nm)之间，具有部分双键性质。参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptideunit)

。肽单元-C

原子为肽平面间的连接点↗↗↗↗↗主链骨架：N-C-C-N-C-C重复

(三)蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

1.

-螺旋

1951年根据X线衍射图提出。-螺旋的要点：1.形成右手螺旋，侧链向外伸出；2.每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm；3.维系化学键：氢键4.氢键方向与螺旋轴基本平行。1、侧链基团的性质；2、侧链基团的大小；3、Pro不利于螺旋的稳定。影响-螺旋稳定的因素：

(1)是多肽链一种比较伸展、成锯齿状的肽链结构。(2)肽段间通过氢键连接，氢键的方向与长轴垂直。2.

-折叠(3)两条肽链走向相同，称为顺向平行结构，反之，则称为反向平行结构。后者更为稳定。顺向平行反向平行(4)R基团交错伸向锯齿状结构的上下方。对-折叠影响较小。3.

-转角肽链出现180°回折的部分形成β-转角；回折部分通常由4个氨基酸残基构成；依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。4.

无规卷曲(四)模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。模体是具有特殊功能的超二级结构。如：αα、βαβ、βββ、螺旋-转角-螺旋等。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键、范德华力等。2.主要的化学键：次级键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。只有具有三级结构的多肽链才能称为蛋白质。1.

定义

(一)定义与主要化学键肌红蛋白(Mb)的三级结构N端

C端(二)结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。免疫球蛋白结构域示意图

(三)分子伴侣1.分子伴侣是一类可识别肽链非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质折叠的保守蛋白质。已发现分子伴侣具有形成二硫键的酶活性，在蛋白质分子折叠过程中对二硫键正确形成起到重要的作用。可逆地与未折叠肽段结合，防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠；

与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。2.作用：四、蛋白质的四级结构

亚基(subunit)：

体内有许多蛋白质分子含有两条或两条以上多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。2.主要化学键

亚基之间的结合以非共价键相连，其次是氢键和离子键。1.定义

蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。(一)定义与主要化学键

血红蛋白是由含有血红素的2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体。血红蛋白的四级结构基本内容主要连接键一级结构二级结构三级结构四级结构小结：蛋白质分子结构aa的排列顺序主链骨架构象主链与侧链构象（所有原子的排布）两个或两个以上亚基的排布肽键氢键次级键非共价键五、蛋白质的分类

(一)根据蛋白质组成成分1.单纯蛋白质2.结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分(二)根据蛋白质形状1.纤维状蛋白质：角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白2.球状蛋白质：胰岛素、血红蛋白(三)根据蛋白质功能1.活性蛋白质：酶、蛋白激素、运输和储存蛋白、运动蛋白、受体蛋白2.非活性蛋白质：角蛋白、胶原蛋白辅助因子第三节蛋白质结构与功能的关系(TheCharactionbetweenStructuresandFunctionsofProtein)蛋白质一级结构与功能的关系

一级结构决定蛋白质的空间结构；一级结构决定蛋白质的生物学功能。蛋白质空间结构与功能的关系

蛋白质构象是其生物学功能的基础，构象改变功能改变。（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性26110958472584065HSSHSHHSHSSHHSHS26110958472655840（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能胰岛素氨基酸残基序号A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochromeC)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。

（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbS

β肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。二、蛋白质的功能依赖特定的空间结构肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基血红素结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似肌红蛋白(myoglobin，Mb)

血红蛋白(hemoglobin，Hb)Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。

如果是促进作用则称为正协同效应；

(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应。

(negativecooperativity)血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。变构剂(效应剂)变构蛋白（三）蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病(CJD)、阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)、亨廷顿舞蹈病(Huntingtondisease)、疯牛病等。例：疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常PrP富含α-螺旋，称为PrPC。在某种未知蛋白质作用下转变成为β-折叠的PrPSc，从而致病。第四节蛋白质的理化性质(ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein)一、蛋白质的两性解离和等电点(一)蛋白质是两性电解质

蛋白质分子中可解离的基团

多肽两端游离的α-氨基和α-羧基多肽侧链R上解离的基团决定蛋白质解离成正负离子的因素

蛋白质所含酸性和碱性基团的数目蛋白质所在溶液的pH值当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。(二)蛋白质的等电点(pI)PrNH2COO-PrNH3+COOHPrNH3+COO-OH-H+(pH＜pI)(pH＝pI)(pH＞pI)OH-H+蛋白质的阳离子蛋白质的兼性离子蛋白质的阴离子电场中向负极移动不移动向正极移动

血浆中，大部分蛋白质的等电点在pH5.0左右，因而在生理条件下，血浆蛋白质带电荷。

人体内，组成蛋白质的氨基酸以酸性氨基酸居多，所以大部分蛋白质的等电点在7.0以下。?负二、蛋白质的胶体性质蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万～

100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉三、蛋白质空间结构破坏而引起变性在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。(一)

蛋白质的变性(denaturation)1.变性的本质

即破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质肽链的一级结构。2.导致变性的因素如高温、高压、强酸、强碱、有机溶剂、重金属离子、生物碱试剂及辐射等因素。3.变性后溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。4.应用举例①临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。②防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

③鸡蛋、肉类等经加温后蛋白质变性，熟后更易消化。5.复性(renaturation)

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性HSSHSHHSHSSHHSHS2611095847265584026110958472584065如：牛核糖核酸酶的变性和复性(二)蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白质疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不一定变性，如盐析。盐析(saltprecipitation)：

是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

凝固实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。(三)蛋白质的凝固作用蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸或强碱中。

四、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。五、蛋白质的呈色反应(一)茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。

(二)双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。(三)Folin-酚试剂反应

蛋白质分子中酪氨酸残基在碱性条件下能与酚试剂反应生成蓝色化合物。该反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍。第五节

蛋白质的分离纯化与结构分析

(TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein)一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物1.透析法(dialysis)

利用半透膜把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。血液透析透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋2.超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。二、丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法

盐析——盐能破坏其水化膜，中和其所带电荷，而且不会导致蛋白质变性有机溶剂（乙醇、丙酮等）沉淀——破坏其水化膜生物碱试剂沉淀——中和其正电荷重金属盐沉淀——中和其负电荷将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

免疫沉淀法：三、电泳(elctrophoresis)2.影响电泳的因素：

所带电荷的性质、数量、分子大小、形状定义：带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象。2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。几种重要的蛋白质电泳：1、醋酸纤维薄膜电泳：根据蛋白质电荷量和分子量差异测定。2、等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质。3、双向凝胶电泳：蛋白质组学研究的重要技术。四、层析(chromatography)原理:待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据待分离的Pr颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使Pr组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相达到分离蛋白质的目的。离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。常用的层析方法：2.凝胶过滤(gelfiltration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。五、超速离心(ultracentrifugation)超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。六、多肽链中氨基酸序列分析分析蛋白质中氨基酸残基组成多肽链的氨基末端与羧基末端的测定两种以上方法水解肽链，得到一系列大小不同的肽段测定各肽段的氨基酸排列顺序分析有重叠结构的各个肽段序列，推导出完整肽链中氨基酸顺序通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定二级结构测定通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。三级结构测定X射线衍射法(X-raydiff