分子克隆课件

分子克隆（一）基本概念:克隆（Clone)指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（MolecularCloning)是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）分子克隆的路线DNA重组转化分子克隆的基本过程分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接筛—重组DNA的筛选与鉴定转—重组DNA导入宿主细胞目的基因的获取-----PCR技术:定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…thermus

aquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus

aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在

1989

年，Science

将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子

(Molecule

of

the

year)

①94℃变性②

50-65℃退火③72℃延伸2.PCR反应过程：20-40个PCR循环1个PCR循环PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火

①模板：单链或双链DNA

②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活剂

3.PCR基本要素4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35个循环

3.与反转录相关的PCR扩增RT-PCR（reversetranscriptase-PCR,RT-PCR):

又称反转录PCR,是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析。ＲＴ－ＰＣＲＤＮＡ聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶反转录TTTnTcDNA第一链mRNAPCR结果图

重组DNA导入宿主细胞的类型转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转导：以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程类型重组DNA的筛选与鉴定PCR筛选重组体原位杂交技术4123重组DNA的筛选与鉴定方法平板筛选（插入失活、蓝白筛选）

2.分子克隆中常用工具酶：（1）.使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶。（2）.催化核酸合成的酶类：

DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。

是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。Ⅱ.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，RE)的定义限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无校正功能。

催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNAligase)。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶

Ⅲ.DNA连接酶：

3.基因克隆常用载体目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等

（二）分子克隆的基本过程⑵.质粒载体：质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。

氨苄青霉素抗性(ampicillinresistance，ampr)基因：此基因编码ß内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。

遗传选择标记：

DNA限制性内切酶DNA连接酶100μl4.目的基因的分离与制备⑴、人工合成基因⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因（二）分子克隆的基本过程5.目的基因的体外重组

DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应。（二）分子克隆的基本过程6.重组子导入宿主细胞体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。

（二）分子克隆的基本过程⑴感受态细胞(competentcell):

系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。⑵转化过程：①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。（二）DNA进入细胞：③.通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。④.然后将细胞接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。⑤.挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。

7.阳性重组子的筛选和鉴定

（二）分子克隆的基本过程大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kan