基因序列分析2013年1024

基因序列分析的基本策略房明丽分子生物学教研室联系方式：Strategiesforanalyzinggenesequence第一页，共84页。基因的序列组成分析（一级结构）基因的含量的分析基因的修饰水平分析（甲基化）测序NorthernBlot实时PCRRT-PCR基因序列分析的基本策略限制性片段长度多态性分析核酸分子杂交焦磷酸测序第二页，共84页。1.DNA序列测定2.限制性片段长度多态性分析3.核酸分子杂交（一）基因的序列组成分析第三页，共84页。1.DNA序列测定（DNAsequencing）基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序.第四页，共84页。（1）Sanger双脱氧末端终止法单脱氧核苷酸（dNTP)背景知识ATCG3’-5’磷酸二酯键双脱氧核苷酸(ddNTP)

不能与下一个脱氧核苷酸结合!第五页，共84页。（1）Sanger双脱氧末端终止法背景知识在PCR反应体系中，如果只加入一条引物是什么样子的结果？单引物只能扩增单链DNA扩增的包含引物的单链DNA不对称PCR(asymmetricPCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).第六页，共84页。（1）Sanger双脱氧末端终止法DNApol原理合成一系列长短不同的以G为结尾的DNA片段测序PCR反应体系第七页，共84页。原理（1）Sanger双脱氧末端终止法第八页，共84页。（1）Sanger双脱氧末端终止法原理PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳泳道上长短不同的寡核苷酸片段在变性聚丙烯凝胶中泳动的距离不同第九页，共84页。MOVIE第十页，共84页。

OHHdNTPddNTPDNA聚合酶TemplatePrimerNewstrand*以不对称PCR技术为中心，*利用双脱氧核苷酸终止新链的延伸，*从而获得在任何一个核苷酸上随机终止的一系列长度不同的DNA片段。*变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段（1）Sanger双脱氧末端终止法小结第十一页，共84页。缺点：（1）Sanger双脱氧末端终止法手工测序泳道间迁移率有差异，对测序的精确性有一定的影响放射自显影条带较宽，读序列困难全自动激发荧光DNA测序第十二页，共84页。（2）全自动激光荧光DNA测序原理基于sanger双脱氧法，第一代测序技术，应用十分普遍。实现制胶，进样，电泳，检测数据分析全自动化。测序长度可以超过1000bp，准确率可达到99.999%第十三页，共84页。荧光标记四种ddNTP，只需做一个反应。。

四色荧光法赋予DNA片段4种不同的颜色一个样品的4个反应产物可在同一泳道内电泳第十四页，共84页。

自动化的毛细管电泳DNA测序仪：其实它就是将测序PCR产物进行PAGE，电泳时激发出四色荧光，并进行软件分析。

四色荧光法第十五页，共84页。

基于Sanger原理的DNA测序法可以分析基因的一级结构序列。分析人工重组的基因分析鉴定基因和基因组分析基因的定点突变长度可达到1000bp可检测未知基因每次只能检测一个样本新型的测序技术第十六页，共84页。（3）焦磷酸测序法焦磷酸测序是一种可行的方法特点：测序长度短于sanger法，定量测序，操作简单，结果可靠。单核苷酸多态性位点（SNP)分析等位基因频率测定细菌和病毒等微生物分型鉴定疾病相关基因序列的突变位点基因CpG甲基化的分析焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术第十七页，共84页。（3）焦磷酸测序法背景知识：什么是焦磷酸？提问:先回忆一下什么是ATP?ATP是怎么水解的？ATP水解实际上是指ATP分子中高能磷酸键的水解。ATPADP+磷酸盐

分子简式：A—P～P～PAMP+磷酸盐AMP+2分子磷酸盐（P~P)焦磷酸第十八页，共84页。（3）焦磷酸测序法焦磷酸测序实际上就是酶促反应测序技术背景知识：先认识一下焦磷酸测序种所用到ATP硫酸化酶荧光素酶三磷酸腺苷双磷酸酶DNA聚合酶

ATP硫酸化酶

PPi+5’磷酸化硫酸腺苷（APS)—————————>ATP

荧光素酶，ATP

荧光素

—————————>氧化荧光素两种特殊底物四种酶：APS,荧光素第十九页，共84页。（3）焦磷酸测序法

原理双磷酸酶荧光素酶硫酸化酶APS+荧光素+DNA聚合酶第二十页，共84页。第一步：加入测序引物，相关酶，底物，和其他试剂第二步：每次加入一种dNTP,如果结合，则会产生一个焦磷酸（PPi）第三步：硫酸化酶转化PPI为ATP,ATP使荧光素酶发出荧光。（产生的荧光强度与结合的核苷酸成正比）第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环。（3）焦磷酸测序法测序原理看一下视频第二十一页，共84页。（3）焦磷酸测序法结果分析每次向反应体系中加入一种dNTP相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比1分子dNTP掺入，释放出1分子的ppi，生成1分子的ATP,产生单位强度的光信号序列：TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA第二十二页，共84页。（3）焦磷酸测序法特殊注意dATP需要选择替代物dATPS。dATPS不是荧光素酶的底物DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高。第二十三页，共84页。（3）焦磷酸测序法技术流程多孔测序，一次可检测96个样本第二十四页，共84页。（3）焦磷酸测序法应用（举例说明1：应用焦磷酸测序法检测纯合子和杂合子）SNP182A/G第二十五页，共84页。（3）焦磷酸测序法应用（举例说明：应用焦磷酸测序法检测SNP位点）单核苷酸多态性(SNP)基因组上单个核苷酸的变异,一般而言,变异频率大于1%的单核苷酸变异可称为SNP.人类基因差异小于1%，但是人类的表型及对疾病的易感性差异很大，都可能与SNP相关。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP.第二十六页，共84页。1.EFGR过表达于大量的肿瘤组织，在肿瘤的生长，分化种起着重要的作用。2.抗EFGR单克隆抗体具有良好的抗肿瘤活性。3.抗EFGR单克隆抗体治疗肿瘤时个体差异明显。如何预测这种个体差异，是目前抗EGFR肿瘤治疗时面临的一个首要问题。第二十七页，共84页。K-ras基因突变致使细胞内KRAS蛋白持续活跃从而导致抗EGFR的抗体耐药K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用检测患者细胞内KRAS基因的状况可以预测该患者对特定药物的临床反应；第二十八页，共84页。KRAS基因突变主要发生在密码子12，13上第二十九页，共84页。密码子12/13发生变异的患者第三十页，共84页。应用（举例说明：应用焦磷酸测序法检测DNA甲基化）第三十一页，共84页。5’甲基胞嘧啶在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶焦磷酸测序法检测DNA甲基化焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点焦磷酸测序技术可检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平第三十二页，共84页。1.DNA序列测定2.限制性片段长度多态性分析3.核酸分子杂交（一）基因的序列组成第三十三页，共84页。2.限制性片段长度多态性分析(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)DNA多态性在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异，称为中性突变(即不引起生物体的表型的改变)，它导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性DNA多态性如发生在内切酶识别位点上，酶解该DNA可产生长度不同的片段。第三十四页，共84页。RFLP原理：

由于DNA变异，产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失。用限制性核酸内切酶消化时，产生不同长度或不同数量的片段第三十五页，共84页。RFLP应用举例镰刀性贫血病的诊断原理

该病由β－球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG)导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。第三十六页，共84页。第三十七页，共84页。1.DNA序列测定2.限制性片段长度多态性分析3.核酸分子杂交（一）基因的序列组成第三十八页，共84页。3.核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程。提问：什么是分子杂交？DNARNARNADNA第三十九页，共84页。根据分子杂交的原理，利用一条已知的核酸序列，用这条核酸量可以检测出有没有与其互补的碱基序列。被标记上可检测信号的、已知序列的单链核酸片段

(RNA或DNA探针探针是如何被标记上的？第四十页，共84页。探针的标记同位素标记物：32P，35S，3H非同位素标记物：生物素、地高辛、荧光素缺口平移法5’3’3’5’3’5’3’5’DNaseⅠDNA边降解边合成DNA合成时参入标记的单核苷酸第四十一页，共84页。随机引物法DNA合成时参入标记的单核苷酸第四十二页，共84页。将已知序列的核酸片段(单链RNA或DNA)进行标记,使之带有特殊可检测信号，作为探针，与未知DNA或RNA单链进行分子杂交,检测未知DNA或RNA单链中，是否存在与探针序列互补的特定序列。探针杂交过程第四十三页，共84页。探针技术2.加入变性的探针DNA1.变性3.杂交4.检测杂交体探针技术第四十四页，共84页。利用核酸探针检测DNA的核酸杂交称作Southern印迹杂交利用核酸探针检测RNA的核酸杂交称作Northern印迹杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交，原位分子杂交第四十五页，共84页。Southern印迹杂交

1975年，英国人EdwinMellorSouthern创建①制备待测DNA样品、标记基因探针；②电泳分离待测DNA样品；③待测DNA样品的变性、转膜；④杂交；⑤显色。将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程，基本流程如下：

第四十六页，共84页。Southern印迹杂交第四十七页，共84页。

①.将内切酶消化的DNA片段进行电泳分离DNAIsolation

REDigestion

Agarosegelelectrophoresis②.

胶中的DNA经变性及中和后,转膜Neutralize

Blot：TransferDNAontoNCmembraneDNAisdenaturedbyNaOHSouthern印迹基本操作过程第四十八页，共84页。

转膜方法（1）dry毛细管虹吸法Southern转膜示意图第四十九页，共84页。

第五十页，共84页。

转膜方法（2）电转法转膜装置示意图第五十一页，共84页。

标记的探针杂交袋将硝酸纤维素膜放入杂交袋中：预杂交

杂交（与标记的核酸探针共孵育）洗膜放射自显影后的X光底片将硝酸纤维素膜与X-光片曝光④.检测杂交信号:

放射自显影（或显色）③.标记的探针与DNA的杂交琼脂糖胶取下硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜MSouthern印迹基本操作过程第五十二页，共84页。Southern印迹的应用Southern印迹杂交在产前诊断、DNA图谱分析及癌基因检测等方面有重要价值。可将具有一定已知顺序的某基因的DNA片段，标上放射性核素，构成核酸探针，将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行诊断。镰状红细胞贫血患者的基因诊断第五十三页，共84页。

突变杂合子镰状红细胞贫血患者的基因诊断正常的（N）的ASO探针：

5´-ACTCCT

GAG

GAGAAGTCTGC-3´突变的（M）的ASO探针：

5´-ACTCCTGTG

GAGGAAGTCTGC-3´突变序列的探针正常序列的探针正常纯合子突变纯合子镰状红细胞贫血是由珠蛋白的β基因发生单一碱基突变引起，正常β基因的第6位密码子为GAG（编码谷氨酸），突变后为GTG（编码缬氨酸）第五十四页，共84页。

将电泳分离的待测RNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA。基本程序：1、RNA的电泳2、转膜:将RNA转移到固相支持物上3、杂交:膜上的RNA的与探针的杂交4、检测杂交信号Northern印迹杂交第五十五页，共84页。与SouthernBlot极为相似与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳:甲醛变性电泳转膜：不需变性第五十六页，共84页。斑点杂交（DotBlot）将RNA或变性DNA样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，烘烤固定，然后与特定探针进行杂交。优点：简单、快速、可同时检测多个样品第五十七页，共84页。荧光原位分子杂交（FISH,FluorescenceInSituHybridization）

在保持细胞基本形态的情况下（不从组织或细胞中提取核酸），用探针在细胞的原位检测靶DNA的存在情况--Chromosome+DNAprobe--LocatespecificgeneonChromosome第五十八页，共84页。DNA芯片技术(Genechip)是指在固相支持物上直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。样品被标记荧光探针被固定到固相支持物上。高通量，自动化第五十九页，共84页。正常组织异常组织对照组mRNA实照组mRNACy5标记mRNACy3标记mRNA等量混合激光扫描信息分析DNA芯片技术数据分析第六十页，共84页。DNA芯片的应用cDNA芯片：可用于分析肿瘤组织mRNA表达的情况。因此，可用于寻找和鉴定与疾病相关的基因。

例如，北京大学的科研人员应用基因芯片技术，发现了在前列腺癌的发生、发展中起重要促进作用的基因，从而为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的依据。第六十一页，共84页。基因的序列组成分析（一级结构）测序分析限制性片段长度多态性分析Sanger法测序焦磷酸测序核酸分子杂交分析Southern印迹杂交Northern印迹杂交点杂交基因芯片技术第一部分小结第六十二页，共84页。RT-PCR分析实时PCR（二）基因的量分析ProteinGenemRNANorthernblotWesternblot在mRNA水平上的分析在蛋白质水平上的分析第六十三页，共84页。1.Northern印迹(Northernblot)模板mRNA（template)核酸探针（probe)碱基互补配对

利用核酸分子杂交方法检测RNA的方法定性分析（有or无）相对定量分析？如果固定一些条件：模板mRNA来源的细胞数量操作中各个环节的准确计量模板mRNA等量上样电泳内掺照Northernblot——逐渐被RT-PCR所替代第六十四页，共84页。2.RT-PCR技术背景知识：什么是PCR?又叫做聚合酶链式反应，是体外特异性扩增目的基因的技术。什么是RT-PCR?又叫做反转录PCR，将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。第六十五页，共84页。PCR的原理?PCR的基本程序：

1.模板的变性

2.引物的退火

3.新链的延伸25~30Cyclesoftheabove3stepsTaqpol，dNTPs第六十六页，共84页。特异性的扩增了DNA片段

DNA片段以2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。聚合酶链式反应(PCR)的结果第六十七页，共84页。RT-PCR的原理?mRNA1.ReverseTranscription2.PCROligodTAMV

DNAPol最后都进入平台期第六十八页，共84页。RT-PCR可相对定量分析特定mRNA内掺照:在一个PCR反应中加两种或两种以上引物外掺照:用等量相同模板不同引物平行进行两个或多个PCR反应参照物：一般选择管家基因如:-actin

-actinGAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)第六十九页，共84页。组成性表达多拷贝基因，mRNA量丰富可能存在假基因如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、编码线粒体蛋白基因、编码糖酵解酶基因用RT-PCR相对定量检测特定基因的转录产物mRNA时一定要避免基因组的污染跨越内含子设计引物可在一定程度上解决这种问题问：为什么选择管家基因作为参照物？House-keepinggene第七十页，共84页。3.荧光实时定量PCR技术实时定量PCR技术（real-timequantitativepolymerasechainreaction,real-timeqPCR）是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及半定量分析实时PCR技术：

通过对PCR反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板（DNA/cDNA)浓度的定量分析。第七十一页，共84页。原理3.荧光实时定量PCR技术1.TaqMan探针法

TaqMan探针是一种水解型杂交探针，在合成其所在的DNA链时就会发出荧光2.SYBRGreen荧光染料掺入法SYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，只与双链DNA结合才能发出荧光，通过观察荧光信号强度来反应体系中双链DNA分子的量。

第七十二页，共84页。TaqMan探针法3.荧光实时定量PCR技术什么是TaqMan探针？探针分子的3’端是荧光素淬灭基团RQ探针分子的5’端是报告荧光5’Reporter3’Quencher与目标序列互补荧光基团、淬灭基团距离较近：无荧光信号！第七十三页，共84页。5’3’5’3’RQ1.变性:无荧光信号Primer5’Primer

TaqMan探针在PCR各步骤中发生的变化：第七十四页，共84页。2.退火:无荧光信号3’5’探针与模板杂交Hybridization5’3’5’3’RQPrimerPrimer第七十五页，共84页。3.延伸:

DNA聚合酶切下5’端荧光素，出现荧光RQ5’3’5’3’RQQRRExcitation第七十六页，共84页。