实验操作前准备

实验操作前准备第1页/共30页溶剂处理

溶剂特性(技术指标)纯度

黏度

折光指数

沸点

毒性

UV透明/UV-截止

溶解性

第2页/共30页溶剂相溶性名称乙酸丙酮乙腈苯丁醇四氯化碳氯仿环己烷环戊烷二氯乙烷二氯甲烷二甲基甲酰胺二甲亚砜二氧六环乙酸乙酯乙醇乙醚庚烷己烷甲醇甲乙酮I-辛烷戊烷I-丙醇四氯乙烷四氢呋喃甲苯丁醇I-丙醇二丙醚三氯乙烷乙酸丙酮乙腈苯四氯化碳氯仿环戊烷环己烷二氯乙烷二氯甲烷二甲基甲酰胺二甲亚砜二氧六环乙酸乙酯乙醇乙醚庚烷己烷甲醇甲乙酮I-辛烷戊烷四氯乙烷

四氢呋喃甲苯水二甲苯三氯乙烷水r二甲苯二丙醚不相溶相溶异丙醇是一种理想的过度溶剂第3页/共30页溶剂的UV-截止波长溶剂UV截止(nm)乙腈190水190环己烷195己烷200甲醇l210乙醇210乙醚220二氯甲烷220氯仿240四氯化碳265四氢呋喃280(220)甲苯285UV截止是用1cm比色池，以空气为参比测定时吸光度为1的波长。第4页/共30页流动相准备主要步骤

量取每种溶剂的适当体积

混合溶剂流动相过滤

流动相脱气第5页/共30页灌注HPLC系统第6页/共30页灌注HPLC系统第7页/共30页灌注HPLC系统第8页/共30页灌注HPLC系统第9页/共30页灌注HPLC系统第10页/共30页灌注HPLC系统第11页/共30页灌注HPLC系统第12页/共30页灌注HPLC系统第13页/共30页灌注HPLC系统第14页/共30页灌注HPLC系统第15页/共30页灌注HPLC系统废液管第16页/共30页样品准备特氟隆-憎水性膜，耐溶剂、酸和碱.该滤膜一般用于非水样品.pH范围114.醋酸纤维素-水相生物样品的良好滤膜，蛋白质保留性能弱.pH范围4-8.聚偏二氯乙烯-耐大部分溶剂,与蛋白质结合力弱.pH2-12.超滤膜-用于生物样品的分子量截止滤膜.尼龙-亲水性膜，过滤水和以水为溶剂的样品,121ºC自动分解,pH范围3-12,不能用浓酸硝化纤维素-有高的蛋白质保留性能.固相萃取

最基本的要求-过滤样品第17页/共30页样品准备将样品溶解在流动相或比流动相弱的溶剂中

进样体积应尽可能小样品溶解在流动相中样品溶解在较强的溶剂中第18页/共30页色谱柱保存

避免对色谱柱施加任何物理应力

柱两端封好避免溶剂挥发干

用适当的溶剂彻底冲洗后再保存

记录色谱柱的使用历史第19页/共30页色谱柱安装每根色谱柱均标明了流动相的流动方向!流动方向是用箭头或文字标示的.不要改变此流动方向,否则会降低色谱柱性能.第20页/共30页色谱柱安装需要什么:正确的接头以防止任何泄漏.

保护柱以保护分析柱

正确的工具第21页/共30页色谱柱安装（续）实用提示:

用手拧紧

再用扳手拧1/4圈(指的是钢制接头）第22页/共30页色谱柱平衡用流动相平衡

避免对色谱柱的压力冲击.

反相色谱需要5-10倍柱体积的流动相进行平衡.

保证结果的重现性.第23页/共30页色谱柱测试

新的色谱柱应当附带性能测试结果（合格证），使用前应该测试一下性能!第24页/共30页色谱柱维护

使用后选择合适的溶剂冲洗色谱柱，将柱中保留作用很强的样品组分彻底冲洗出去.

不要用100%的水保存色谱柱，否则会生长细菌并堵塞色谱柱.

如果想保持色谱柱性能，就不要打开柱两端的封头，也不要重新装填固定相.

在最佳流速条件下使用色谱柱-避免高流速.不要在高温下长时间使用硅胶或键合相色谱柱.

控制流动相的pH在色谱柱适合的范围.第25页/共30页系统校验系统校验的准备工作:

用流动相灌注了HPLC系统.

平衡色谱柱.

检测器基线稳定.

无泄漏.

系统准备好进样第26页/共30页系统校验（续）Testdesign:调出所要使用的方法文件开始测试标液.将所得结果与前期结果相比.结果若正常，则说明系统性能良好，可以使用.第27页/共30页小结

准备流动相

灌注HPLC系统

安装色谱柱

启动检测器(对于UV检测器至少预热20分钟)

平衡色谱柱准备样品

记录检测器响应-基线稳定

用标液进行系统校验

将结果与前期结果比较

记录结果(作为对照)

如果有任何故障/出错，就记录下来

如果系统校验合格,您就可进行样品分析第28页/共30页课后思考题1.您在进行一个分析时，发现基线周期性地波动.压力读数上下波动。问题的原因是什么?您如何解决此问题?

2.您决定用实