第二章-组培资料2713

第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术第一节植物组织培养的基本理论一、植物细胞的全能性及其表达1.植物组织培养(Planttissueculture)：在离体条件下，利用外植体(explant)：由活体(invivo)植物体上提取下来的，接种分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养(organculture)、茎尖分生组织培养(shoottipculture,shootapexcultrue)、细胞培养(cellculture)、原生质体培养(protoplast2.植物细胞的全能性(totipotency)：一个具有完整细胞核的植物化)＞特化细胞(筛管等细胞)。胞全能性的表达全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植全能性只是一种可能性。完整细胞核具有该植物体全套的遗传信1)脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制；2)营养和激素，使其脱分化与再分化。二、植物细胞的脱分化与再分化化(Celldifferentiation)1)成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。2)生理生化分化先于形态结构分化。3)完整植株中，细胞发育途径一旦被决定常不再改变，而离体培养4)极性是植物细胞分化的基本现象，即在器官、组织、细胞中，在5)由不等分裂导致细胞分化的差异，说明细胞质在起作用。6)有位置效应，可能与生理状态和激素分布有关，导致基因表达差7)植物生长调节剂对细胞分化有关键调节作用。8)细胞分化时，常见核内多倍性和多线染色体。3.愈伤组织(callus):在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分4.再分化/再生(redifferentiation/regeneration):由脱分化生的途径：2)体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)：从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构(体细胞胚)，进一步发育成完整植根芽根芽脱分化脱分化官、组织和细胞第二节植物组织培养的基本条件2.接种室(无菌操作室)4.细胞学实验室3.湿度：室内相对湿度70%~80%,过低使培养基失分，过高易造第三节培养基及其配制剂＋其它。HPCa:CaCl2.2H2O;Cu：CuSO4;Fe:FeSO4.7H20与Na2EDTA.2H20的螯合物；B:H3BO3;Mn:MnSO4.H20；MoNa2MoO4Co:CoCl2.6H20Zn:ZnSO4.7H201)糖：常用蔗糖(2%~5%)，葡萄糖和果糖等也用，大规模生产用绵白糖/砂糖。最常用的碳源(Carbonsource)是蔗糖(sucrose)，葡萄糖和果糖(GlucoseandFructose)也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖(Maltose,galactose,mannoseandlactose)在组织培养中也有应用。蔗糖使2)维生素：用量一般0.1~1.0mg/L。4)氨基酸及有机添加物：常用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；也用水4.植物生长调节物(plantgrowthregulator)开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理1)生长素类(auxin)：用量0.01~10mg/L。人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成IBA(indolebutyriacid，吲哚丁酸):促进发根能力较强的生长2)细胞分裂素类(cytokinin)：用量0.1~10mg/L。BAP卞氨基嘌呤)；2-ip(异戊烯基腺嘌呤)等。3)赤霉素(Gibberellins,GA’s)4)脱落酸(AbscisicAcid,ABA)。模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长5.固化剂1)琼脂(agar)：用量6~10g／L。2)其他：滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有养基的渗透压培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透2.B5：含较低的铵(常抑制生长)，适合于双子叶特别是木本植物。stocksolution配制制1)在烧杯中放入一定量的水，依次加入大量元素、微量元素、有机2)加入蔗糖；3)如果需要，加入肌醇等大量成分；5)加琼脂；6)装在大三角瓶中灭菌后分装，或先分装再灭菌。有机物分解、糖焦化、盐沉淀、难凝固(琼脂解聚)。第四节离体无菌操作技术1.1高压高温蒸气灭菌(培养基、器皿、用具)点不断提高，锅内温度也随之增加。在1atm/cm2(0.1Mpa)的压力1.2灼烧灭菌(金属器械)1.3过滤除菌(不耐热物品)1.4干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)1.5紫外线照射灭菌(接种室、超净台)化学灭菌2.2熏蒸灭菌中操作步骤：1.打开超净台风机hood，开紫外灯照20min左右；剂的使用浓度及时间使使用浓度(%)处理时间(min)去除难易易易易有无无好好好0.1~110mg/L、外植体的灭菌与接种1)基因型：影响培养难易和再生途径，草本比木本、双子叶比单子3)发育年