医学免疫学实验三 双抗体夹心ELISA法检测CEA

实验三：

双抗体夹心ELISA法检测CEA酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。实验原理2实验原理实验原理1.已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面（聚苯乙烯微量反应板，利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其免疫学活性2.抗原抗体的特异性结合以已知抗原检测未知抗体

以已知抗体检测未知抗原3.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性

结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比3实验原理

实验原理

4.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。4★常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定（30min内），否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。★ELISA法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。5OPD（邻苯二胺）被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202)氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB）。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。TMB（四甲基联苯胺）是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深。过氧化氢(H2O2)作为HRP底物之一.TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常用的色原底物。HRP的色原底物6450nm或405nmTMB（四甲基联苯胺）OPD（邻苯二胺）492nm7ELISA的类型★双抗体夹心法★竞争ELISA★间接ELISA★BAS-ELISA法直接法（一步法）间接法8结合抗原洗涤结合酶标抗体显色（读数）双抗体夹心ELISA基本过程抗体包被封闭结合位点洗涤洗涤，加底物反应思考：抗体是如何包被在固相载体上的？封闭的作用？抗原结合的特点？为何要有洗涤步骤？颜色反应为何能反映出抗原的量？如何避免出现显色深度与抗原量成反比的情况？无需洗涤9CEA（癌胚抗原）CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬化变病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20μg/L，CEA超过20ng/ml时往往提示有消化道肿瘤。所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。10实验材料1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体）2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）3.样品1和样品24.酶标抗体

（酶结合物）5.底物液A和底物液B（显色剂A和B）6.终止液7.洗涤液实验材料底物A和B为何要分开11每组8个孔，其中6个孔做标准品2个孔做样品1和样品20ng5ng10ng20ng40ng80ngS1S2分别加100μl于每孔，37℃湿盒，30min加入酶结合物100μl于每孔，37℃湿盒，30min分别加显色剂A和B各1滴混匀，37℃湿盒，15min（避光）加终止液1滴肉眼观察结果并读取OD450值注意：洗涤液的量逐渐递增结果观察：

肉眼观察（定性或半定量试验）

酶标仪检测（定量试验）洗涤4次洗涤4次为何要做标准曲线进行定量？12管号123456标准品浓度（ng/mL）0510204080OD450值0.0190.1190.2060.4250.851.696数据分析举例以1~6孔的标准品OD值制备标准曲线，获得回归方程将待测样品1和2的OD值带入公式，如样品1，OD为0.164，求得含量7.4ng/mL（肉眼观察接近第2~3管）;样品2，OD为0.802，求得含量37.8ng/mL（肉眼观察接近第5管）13注意事项注意事项包被：样品若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。

（常规包被2-8℃冰箱过夜）

试剂盒要注意保质期孵育：1)贴封片或加盖，置湿盒；2)按说明步骤严格控制操作时间。洗板：保证洗液注满各孔，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干。若用洗板机，请保持洗板针畅通。显色：显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂终止：在加终止液时应避免产生气泡。6.读板

：若用机器读板，应保证酶标板底部清洁。14实验报告分析实验一检测结果与预期（他组）结果的比较不同检测方法

2.误差来源分析：A.两点定标和多点定标B.多次重复或复孔检测