蛋白质结构分析课件

第二章蛋白质结构分析第一节蛋白质样品的准备

进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度>95％。这样的样品，通常是用色谱和电泳精制过的。一、SDS—PAGE纯化的样品从SDS上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使SDS浓度低于0.0005％，否则SDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低HPLC分肽时的分辨率。有报道指出，在2mol／L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白质时，如果SDS浓度>0.05％，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶Lys-C的作用。虽然有报道用HPLC或用盐酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共价结合到蛋白质分子上的SDS分子更难除去。在SDS后，采用电印迹(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方法，因为PVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和去垢剂，因此，蛋白质能和这些“污染物”分开。经过这样处理后，能用于BrCN化学裂解或酶解。二、HPLC纯化的样品如果样品是用反相HPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系统的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因为蛋白质是水溶性的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2ml)润之，再用5ml纯水洗涤；然后样品液体通过Sep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCA沉淀也可以考虑。三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一SH)当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净”，在进行酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂保存在暗处是很稳定的。而且，这类试剂的矫作物(artifact)容易得到放射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。第二节蛋白质的化学裂解裂解于甲硫氨酸(Met)

溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧基端，对多数蛋白质裂解效率为90％以上。BrCN在酸性条件下，裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸(Ⅱ)(homoserine)和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物，它们之间也能相互转化，如图2.1所示。对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是β羟基产生下面的一系列反应(Ⅲ和Ⅳ)，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽键，如图2.2所示。Met-Cys键也不易裂解。典型的反应常常在20℃、70％甲酸(V/V)中进行24h，副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时Trp会氧化。操作：蛋白质先用5％巯基乙醇在pH8.0室温下处理24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸计算)以防止色氨酸氧化。蛋白质以1～5mg/ml浓度溶解在70％甲酸中，加入50倍过量，小体积的BrCN/70％甲酸，通氮并置于暗处，室温放置16～24h，结束后加15倍体积的水，冻干，重复加水冻干。第三节蛋白水解酶酶解一、常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶(trypsin)专一作用在Arg和Lys(碱性氨基酸)的羧基端，但对Arg-Pro和Lys-Pro键没作用。我们常将胰蛋白酶配成1mg/ml，贮存在1mmol/LHCl中，-20℃保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿素增加溶解度，因为胰蛋白酶在2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)内肽酶Lys-C(endoproteinaseLys-c)专一作用在Lys的羧基端。(4)V8蛋白酶(staphylococcalprotease)专一作用在Asp和Glu(酸性氨基酸)的羧基端。pH8.0的磷酸缓冲液时，作用在Glu-X和Asp-X；pH4.0的乙酸缓冲液时，仅作用于Glu-x键。(5)梭菌蛋白酶(clostripain)专一作用在Arg的羧基端。(6)凝血酶(thrombin)专一裂解在Arg-Gly键上，在纤维蛋白原工作中，很大程度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂解点。(7)其他还有专一性较广的胃蛋白酶(pepsin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶(papain)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)等。应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，常常不易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造成混乱。应采购TPCK—胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活性)和TLCK—胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白-酶活性，才能保证酶的专一性。二、酶解操作条件将30µl(100µg)蛋白质，100mmol/LNH4HCO3，pH8.5，5mmol/LDTT，50℃作用15min，在冷至室温后，加5µl100mmol/L碘代乙酸，室温15min，加60µl水，最后加酶5µl[蛋白样品:酶=25:1(质量比)]，37℃保温20-24h，冻干样品或直接注射样品(用稀TFA酸化至约pH2.5)到反相HPLC柱中分析。(4)蛋白酶的量酶和蛋白质的质量比为1:25，如果分子质量大的蛋白质(>6万Da)，则比例要减低至1:50。胰蛋白酶要用序列级的商品。(5)原位酶解将SDS上的蛋白质样品从凝胶上解析下来是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。目前流行的方法是将蛋白质电印迹(blotting)至PVDF类的膜上，直接进行序列分析或直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析(insitu)。

原位酶解操作如下：膜片剪成lmm细条，放在Eppendrof管中,加1.2ml0.5％(m/V)PVP-40/0.1mol/LHAc，37℃保温30min，PVP-40的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗涤膜至少5次以洗净残留的PVP-40(因为PVP-40有很强的紫外吸收，在RP-HPLC中，PVP-40于30％一40％有机溶剂浓度时洗下来，它在215～220nm有很高的吸收，在260～289nm吸收很小)，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在100mmol/LNH4HCO3:CAN=95:5，pH8.2，37℃酶解过夜，对V8蛋白酶则在100mmol/L磷酸钠:ACN=95:5，pH7.8，室温过夜。酶与底物之比为1:10至1:20(质量比)；对亚微克级样品，酶与底物之比高达2:1。酶解后-20℃保存或立刻用数微升10％TFA酸化，上样到HPLC柱上分析。(6)限制性酶解限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草杆菌蛋白水解酶在pH8.0下作用，活性没有变化，但出现一个新的N端丝氨酸。用AmberliteIRC-50离子交换柱，0.2mol/LpH6.25的磷酸钠缓冲液可分离到一个大片段(S蛋白)和一个小片段(S肽)。也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上层液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸样品置于1.5ml的聚丙烯离心管中，加无水TFA，密闭，40℃保温1h，然后打开管盖，让TFA挥发，干燥，再进行序列分析。二、除去N-甲酰甲硫氨酸样品置于1.5ml聚丙烯离心管中，加30µl0.6mol/LHCl，密闭，25℃水解24h，打开管盖，真空除去HCl，然后进行序列分析。以上两种温和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，这与时间、温度、酶浓度有很大关系，过分的酸水解会引起蛋白质中肽键的断裂，如对酸不稳定的Asp-Pro键；相反，条件不够，则封闭的N端基团水解不完全，导致测序的起始点不均一。三、除去N端的焦谷氨酸残基(pyroglutamate)样品在序列仪上测不出N端，则将载有样品的膜片转移至1.5ml聚丙烯微量离心管中，用0.5％PVP-40洗膜片(见上节原位酶解部分)，再加100µl焦谷氨酸氨肽酶(5µg于50mmol/L磷酸钠pH7.0，含10mmol/LDTT)37℃酶解5～10h，用水洗膜，干燥，放回序列仪分析。五、选择性纯化N端封闭的肽蛋白质用胃蛋白酶(pepsin)或嗜热菌蛋白酶(thermolysin)作用后(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上强酸性阳离子交换柱(例Dowex50mmX2mm，H+型)。所有含游离氨基或其他碱性基团的肽都结合至柱上，仅缺少碱性基团的肽通过柱泄出。如果N端是封闭着的(没有游离的N端氨基)，同时因用专一性很广的酶作用，肽较小又不含组氨酸、赖氨酸、精氨酸则可在排出液中发现N端封闭的肽。此技术的局限性是：大肽(甚至含有碱性基团)可能不结合到树脂上，因为它们不渗入树脂孔径内；相反，一些疏水的肽，特别含有色氨酸残基，即是它们缺少游离的N端氨基，也可能结合到柱上。此外，如果存在碱性基团非常靠近N端，胃蛋白酶作用不能除去，则该技术也不见效。应该指出，N端为谷氨酸的肽在极端pH下会环化而转变成封闭，需加以小心。近年来，由于质谱(MS)在生物样品检测中有了长足的发展，可用MS精确测定分子质量的方法来判断封闭的N端为何种基团。第五节蛋白质中的C端残基的测定一、羧肽酶法羧肽酶是最常用的方法，对一些小肽而言，C端有时最容易测定的，如胰蛋白酶酶解肽段时总是以Lys或Arg为C端；BrCN裂解的肽总是以高丝氨酸(homoserlne)为C端；V8蛋白酶酶解的肽总以Glu或Asp为C端。虽然有非专一的情况，但毕竟出现的概率很少。羧肽酶酶解是从C端开始，一个一个地从C端释放出氨基酸残基，这是个动态的释放过程。有的氨基酸释放快些，有的氨基酸释放慢些。对小肽的C端序列测定问题不大，但对长肽的序列测定，由于对不同氨基酸残基释放的速度不同，对后面一些氨基酸的序列判断，可能会出现错误。在这方面不如化学降解法。C端序列分析是在酶解的不同时间间隔，取出一定量的反应物停止反应后，用氨基酸分析定量氨基酸来排列出其序列，近来用质谱法测定C端序列。

(2)羧肽酶B(CpB)从蛋白质/肽的C端释放Lys和Arg，CpB存放在－20℃时，非常稳定。(3)羧肽酶Y(CpY)目前CpY有更广泛的专一性和通用性，一般讲它作用底物C端的疏水性氨基酸快些，作用于带电荷的氨基酸慢些。此酶很稳定，某些金属离子(例如Cu2＋，Hg2＋)抑制酶活性。CpY制剂中可能污染有酵母蛋白酶A，这时可加胃蛋白酶抑制剂(pepstain)抑制，也可用EDTA抑制。CpY用量一般为底物的1/50～1/100，在25℃作用，于不同时间取反应液酸化后分析游离的氨基酸。(4)羧肽酶P(CpP)CpP是种酸性羧肽酶，它贮存在pH5.5的50mmol/L吡啶醋酸缓冲液中，于-20℃，6个月内非常稳定。其作用于pH2.5的100mmol/L吡啶甲酸缓冲液中。二、化学降解法早年的化学降解法只能测定一个C端氨基酸，远远不能满足需求。而羧肽酶法虽能测到3～5个序列，但这是一个动态演绎的方法，有可能错判。十多年前，蛋白质化学家就开始用类似Edman降解法从C端逐个测定氨基酸序列，每次国际蛋白质会议都有报道，直到1995年才有商品仪器供应。目前C端序列仪一般只能测定5个氨基酸残基左右(这和蛋白质的性质有关，有些可测到10个左右)，在nmol水平上；这与N端序列还有很大的差距(目前N端序列仪灵敏度在10pmol，可测到50个循环)第六节蛋白质中一些特殊肽段的检出

一、含巯基肽的分离纯化和分析巯基在蛋白质性质、结构和功能中具有重要作用，因此含巯基肽段的鉴定是蛋白质化学不可缺少的部分。文献上含Cys的肽常用同位素标记的碘代乙酸处理，羧甲基化，然后在HPLC肽谱分析时跟踪有标记的肽段。鉴于用同位素在国内不很方便，我们用4-乙烯吡啶标记蛋白质中的半胱氨酸，酶解后的肽谱，除用214nm检出外，同时还用254nm检出，只有被4-乙烯吡啶修饰的肽在254nm才有吸收，所以能方便地检出。

三、含Lys-肽的分离纯化和鉴定赖氨酸的ε-氨基可以和磷酸吡哆醛(PLP)形成Schiff碱，该衍生物在325rml有特殊的吸收，利用这一性质可找出含有Lys残基的肽