中药色谱分析色谱联用技术

中药色谱分析色谱联用技术第1页，共75页，2023年，2月20日，星期三液质联用系统质量过滤器第2页，共75页，2023年，2月20日，星期三API

电离源LC/MS-

WatersAllianceZMD系统

第3页，共75页，2023年，2月20日，星期三Agilent1100SeriesLC/MSD第4页，共75页，2023年，2月20日，星期三Varian1200LLC/MS&LC/MS/MSProStarBinary210SolventDeliverySystemProStar430AutoSamplerModule1200LLC/MS第5页，共75页，2023年，2月20日，星期三1200LLC/MS/MSAnalyzerSprayChamberDiverterCapillaryPlug&HexapoleIonGuideQ1Q2Curved185mmPathQ3Multiplier+/-5kVpostaccelerationDualStageTurbo第6页，共75页，2023年，2月20日，星期三？？LC与MS联用面临的问题？？将常规LC每分钟约1ml或数ml流速的液体流动相引入要求高真空操作的MS仪，引起流速不协调;经典离子化方法的高温高电压不适合LC分析的热不稳定性或难挥发性样品的离子化;

LC分析常用的难挥发性缓冲盐系统易污染MS仪第7页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC/MS联用的接口技术*直接液体导入接口(DirectLiquidIntroduction)*传送带技术(MovingBeltInterface)流出物滴落在传送带上，红外线加热去溶剂缺点：离子化效率低；记忆效应*热喷雾(Thermospray)流动相经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出形成雾滴，离子蒸发；流速1ml/min，水相多缺点：MW200-1000u；热分解第8页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC/MS：ESI结构图第9页，共75页，2023年，2月20日，星期三FinniganESI第10页，共75页，2023年，2月20日，星期三AgilentESI第11页，共75页，2023年，2月20日，星期三ABESI第12页，共75页，2023年，2月20日，星期三WatersESI第13页，共75页，2023年，2月20日，星期三VarianESISprayChamberCapillaryPlug&HexapoleIonGuide

SampleSprayAssembly第14页，共75页，2023年，2月20日，星期三ElectrosprayIonization,desolvation,

excessdropletremovalN2GasHeaterN2dryinggasVacuumRestrictionDryinggaspromotesrapiddesolvationandblowslargedropletsawayfromcapillaryinletIonsDropletsDropletsDroplets第15页，共75页，2023年，2月20日，星期三ElectrosprayMechanism++++++++++++++++DesolvationNeedleChargedDropletAnalyteIonization第16页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC-MSionization第17页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC-MSionization++++++++++HotDryingGas++++++++++solventsolventsolventsolvent第18页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC-MSionization第19页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC-MSionization第20页，共75页，2023年，2月20日，星期三LiquidNebulizingGasOptimumdependsonliquidflowInnertoouterneedlepositioniscriticaltonebulizationefficiency第21页，共75页，2023年，2月20日，星期三液滴分布状态LargeunchargeddropletsSmallhighlychargeddropletsIntermediatesizedropletsSprayneedleTaylorconeSpreadingduetochargerepulsion第22页，共75页，2023年，2月20日，星期三ElectrosprayIonization,desolvation,

excessdropletremovalN2GasHeaterN2dryinggasVacuumRestrictionDryinggaspromotesrapiddesolvationandblowslargedropletsawayfromcapillaryinletIonsDropletsDropletsDroplets第23页，共75页，2023年，2月20日，星期三进入四级杆质量分析器3.5mTorr0.8TorrDropletsIonsQ1Dropletdesolvationoccursbeforeentrancetothecapillary.Ion/Solventclustersaredissociatedbycollisionsbeforetheskimmerconeandintheionguide.IonsSmallIons

IonGuide第24页，共75页，2023年，2月20日，星期三分析物离子化AnalyteformsanioninthemobilephasePositiveIonESICationattachment:H++M(M+H)+

alsoNa+,K+,NH4+NegativeIonESIProtonloss:M(M-H)-+H+Anionattachment:A-+M(M+A)-

第25页，共75页，2023年，2月20日，星期三示例：稳定母离子的确认定量离子对：多烯紫杉醇m/z830→549.0（[TNa]+，图A）紫杉醇

m/z876→591.0（[TNa]+，图B）

第26页，共75页，2023年，2月20日，星期三不同甲酸浓度下多西他赛母离子的稳定性与灵敏度考察加钠离子（m/z830）2.加钾离子（m/z846）3.加氢离子（m/z808）0‰formicacid0.05‰formicacid0.1‰formicacid0.2‰formicacid第27页，共75页，2023年，2月20日，星期三不同甲酸浓度下多西他赛子离子的稳定性与灵敏度考察0‰formicacid0.05‰formicacid0.1‰formicacid0.2‰formicacid1.加钠离子（m/z549）2.加钾离子（m/z565）3.加氢离子（m/z527）第28页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC/MS：APCI结构图第29页，共75页，2023年，2月20日，星期三APCI:Nebulization&VaporizationAPCIisagasphasereactionAnalytemustbeavailableasastable,gasphasemoleculeMatrixcomponentsmayormaynotundergonon-destructiveevaporationEvaporationdrivenbyaveryhotauxiliarygasliquidgasQuartzTubeQuartzTubeVortexflowofhotgasgas第30页，共75页，2023年，2月20日，星期三IonizationintheAPCIChamberCoronaNeedleCIreactionsoccurbetweenthecoronaneedleandthesprayplateNebulizerandauxiliarygasplusgasphasemoleculesofmobilephase,analyteandmatrixfloodintotheAPCIchamber第31页，共75页，2023年，2月20日，星期三APCI基本原理从液相色谱流出的样品溶液进入一具有雾化气套管的毛细管，经氮气流雾化，通过加热管时被气化。在加热管端进行电晕尖端放电．溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子：

R+eR+·+2eRH++MMH++R第32页，共75页，2023年，2月20日，星期三ESIAPCI对象中等至强极性分子非极性/中等极性不适宜极端非极性样品热稳定性差/非挥发性流动相

pH对离子化效率影响较大缓冲盐浓度低缓冲盐浓度可高些有机相比例不能太低水相比例可高些流速低流速较好高流速比ESI好

第33页，共75页，2023年，2月20日，星期三LCLC/MS：*多数色谱柱与LC/MS匹配，离子交换柱除外*使用有机溶剂比例较高的系统*避免使用难挥发性缓冲盐，可用醋酸铵、甲酸铵、三氟乙酸；*使用挥发性离子对试剂：氢氧化四丁基铵（TBAH），七氟丁酸（HFBA）*流量匹配：兼顾色谱分离效果和ESI离子化效率；用1-2mm内径色谱柱，300-500ul/min；柱后分流第34页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–FullScan全扫描MSModeQ1Q2Q3Fullscan(Q1)Fullscan(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission第35页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–SIM选择离子监测MSModeQ1Q2Q3Selectedionmonitoring(SIM)(Q1)Selectedionmonitoring(SIM)(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmissionSelectedIonMonitoring第36页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–SRM选择反应监测MSModeQ1Q2Q3Selectedreactionmonitoring(SRM)Selectedreactionmonitoring(SRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDCollisioninduceddissociationSelectedReactionMonitoring第37页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–MRM多反应监测MSModeQ1Q2Q3Multiplereactionmonitoring(MRM)Multiplereactionmonitoring(MRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDMultipleReactionMonitoring第38页，共75页，2023年，2月20日，星期三第39页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–PrecursorScan母离子扫描MSModeQ1Q2Q3PrecursorScanMS/MS=scanned;=selectedm/z;=CID第40页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–ProductScan子离子扫描MSModeQ1Q2Q3ProductScanMS/MS=scanned;=selectedm/z;=CID第41页，共75页，2023年，2月20日，星期三ScanModes–NeutralLossScan

中性丢失扫描MSModeQ1Q2Q3PrecursorScanMS/MS=scanned;=scannedwithoffset;=CID第42页，共75页，2023年，2月20日，星期三多种扫描模式设定Allmodesaretimeprogrammable,withnumeroustimesegmentsavailableforeachmethodFullScanSIMSRMMRMPrecursorScanNeutralLoss第43页，共75页，2023年，2月20日，星期三Scan:250-500第44页，共75页，2023年，2月20日，星期三521ESI(-)523ESI(+)第45页，共75页，2023年，2月20日，星期三XIC521XIC523第46页，共75页，2023年，2月20日，星期三ProductScanProductScan:523→100~523361第47页，共75页，2023年，2月20日，星期三NeutralLossScan:400~550→238~388野鸢尾苷第48页，共75页，2023年，2月20日，星期三LC/MS在中药研究中的应用中药化学成分的快速筛选及成分分析质谱检测器可以给出大量的结构信息，结合同类已知结构化合物的裂解规律，或结合其它检测方法，即可对未知成分进行直接分析，因此在以生物活性为指导的化学筛选中，可以对目标化合物进行靶分析中药质量控制--中药指纹图谱研究LC-MS联用技术的应用弥补了紫外检测的不足，还提供了大量的化学成分信息，可实现对各主要流出组分的定性，从而为药材及其制剂的鉴别及质量评价提供更加全面、可靠的依据第49页，共75页，2023年，2月20日，星期三IdentificationofmultiplecomponentsinGuanxinninginjectionusinghydrophilicinteractionliquidchromatography/time-of-flightmassspectrometryandreversephaseliquidchromatography/time-of-flightmassspectrometryRapidCommunicationsinMassSpectrometryXiaofeiChen,ZiyangLou,HaiZhang,GuangguoTan,ZhiruiLiu,WuhongLi,ZhenyuZhuandYifengChai*示例：应用亲水作用色谱-反相色谱互补策略联用飞行时间质谱检测器鉴别冠心宁注射液的主要成分第50页，共75页，2023年，2月20日，星期三研究背景2009年7月，SFDA针对近年来中药注射剂频发质量安全事故这一问题，下发了《关于开展中药注射剂安全性再评价工作的通知》，要求在全国范围内开展中药注射剂安全性再评价工作，并提出了如下要求：

全面开展生产及质量控制环节的风险排查，切实控制中药注射剂安全隐患

因此，将注射液中绝大多数甚至全部成分搞清楚是，并进行针对性的质量控制，是保证中药注射液安全稳定的基础。第51页，共75页，2023年，2月20日，星期三研究背景冠心宁注射液：收载于卫生部部颁标准（1998）由丹参和川芎两味传统中药组成；临床上主要用于冠心病、心绞痛、脑栓塞等心、脑血管疾病的治疗；具有扩张冠状动脉，促进冠脉侧支循环，加速缺血心肌的修复等作用；注射液中主要成分为酚酸类、苯酞类等水溶性成分，——这是通常认为的起作用成分第52页，共75页，2023年，2月20日，星期三糖、氨基酸、有机酸等成分同样也起到一定的作用，辅料的含量也应得到控制，但由于这些物质极性均较强，很难在常规的C18柱上表征。第53页，共75页，2023年，2月20日，星期三色谱条件：RPLC分离使用AgilentZorbaxSB-C18柱(100mm×3.0mmI.D.,3.5µm)，柱温30℃，流动相使用0.4%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱0-19min，2-23%B；19-27min，23-30%B；27-35min，30-90%B；35-45min，90%B。流速0.5mL/min，为了获得更好的电喷雾效率，柱后分流保持0.2mL/min进入质谱分析，进样量为5μL。HILIC分离使用SHISEIDOPCHILIC柱(150mm×2.0mmI.D.,5µm)，柱温40℃，流动相使用5mmoL/L醋酸铵水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱0-10，90%B；10-20min，90-70%B；20-25min，70%B。流速0.2mL/min，直接进入质谱分析，进样量为2μL。第54页，共75页，2023年，2月20日，星期三质谱条件：

检测器为Agilent6200TOF/MS装配ESI离子源。TOF/MS分析使用全扫描模式，质核比范围100-1100，负离子模式。ESI离子源条件如下：干燥气流速，8L/min；干燥气温度，350℃；雾化器压力，35psig；毛细管压力，4000V；碎片电压，130-325V动态调节；skimmervoltage,60V;octopoleRF,250V。第55页，共75页，2023年，2月20日，星期三化合物鉴别策略样品处理1、与对照品比对保留时间、碎片信息与已知碎片骨架信息比对LC-TOF/MS分析,获得色谱峰精确分子量2、在化合物数据库中搜索匹配化合物数据库建立对照品处理3、根据碎片信息推导可能的结构比对质谱标准数据库，尝试鉴别非目标化合物，个别购买对照品确证误差<5ppm，利用[M–H]-、[2M–H]-[M–2H+Na]-等分子离子峰信息匹配最有可能的化学结构式通过查询注射液药材相关的植物化学和药理学相关文献获得，数据库包括化合物的化学式、精确分子量、名称、中文名、来源植物，CAS号，紫外信息，质谱信息，参考文献和注释。与文献数据对比，明确鉴别目标化合物目标化合物非目标化合物第56页，共75页，2023年，2月20日，星期三C18柱TOFMS总离子流图HILIC柱TOFMS总离子流图34个化合物，4组同分异构体17个化合物，1组同分异构体第57页，共75页，2023年，2月20日，星期三非目标化合物的鉴别和确证EIC:m/z=130.0609碎片电压130V128.0351的同位素分布离子12&1、异亮氨酸2、亮氨酸C6H13NO2第58页，共75页，2023年，2月20日，星期三C12H22O11非目标化合物的鉴别和确证[2M-H]—[M+HCOO]—[M-H]—[M-H]—[2M-H]—-162[Glucose-H]—蔗糖第59页，共75页，2023年，2月20日，星期三非目标化合物的鉴别和确证[2M-2H+Na]—[M-H]—[M-H-NH2]—L-苯丙氨酸C9H11NO2第60页，共75页，2023年，2月20日，星期三示例：LC-DAD-MS/MS分离鉴定中药莲子心中三种生物碱莲子心中主要有效成分－双苄基异喹啉类生物碱的药用价值日趋重视。其中，莲心碱（Ⅰ）、异莲心碱（Ⅱ）、甲基莲心碱（Ⅲ）为莲子心中双苄基异喹啉类生物碱的主要成分JPharmBiomedAnal.43(2007)99-104.IF20072.761第61页，共75页，2023年，2月20日，星期三DriedandpowderedembryooftheseedofN.nuciferaGAERTN.(10kg)wassoakedin1%HClfor1week.Thefiltratewasthenprecipitatedwith10%aquaammoniauntilthepHofthesolutionreached8.5and593gofcrudeextractwerecollectedasbrownprecipitates.Thecrudeextractwasextractedthreetimeswithchloroform,andthentheorganicphasewasextractedtwotimeswith3%NaOH.Finally,theextractsolutionwasprecipitatedwithdilutedHClandoff-whiteprecipitateswerefilteredanddriedtoobtainphenolicalkaloidsample(38.5g).Theprimarystocksolutionsofcrudeextract(1mg/ml)andphenolicalkaloidsample(1mg/ml)werepreparedbydissolvingappropriateamount