酶工程制药BETA版

主要内容酶工程制药概述白血病的概述与致病机理L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺酶的修饰及作用机制L-天冬酰胺酶的生产工艺L-天冬酰胺酶在医药领域的应用和发展第一页，共29页。酶工程制药概述

一、酶工程简介

酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。第二页，共29页。酶工程制药概述二、酶的来源目前工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源原因：1.微生物种类多，酶的品种齐全2.微生物生长繁殖快，生产周期短，产量高3.培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，可通过控制控制培养基来提高酶的产量4.微生物具有较强的适应性和应变能力。可通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产菌株。故目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。第三页，共29页。酶工程制药概述三、药用酶的一般要求1在机体内的生理条件下具有较高活力和稳定性；2对底物有较高亲和力,不受产物和体液中正常成分抑制；3在体内有较长的半衰期，可缓慢地被分解或排出体外；4不需要外源性辅助因子；5在生理条件下酶促反应不可逆；6酶制剂纯度高，不含其它毒性杂志，来自非致病性酶源。第四页，共29页。酶工程制药概述四、酶在医药领域的应用1.在疾病诊断方面的应用包括两个方面：①根据体内酶活力的变化来诊断疾病；②用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病。2.在疾病治疗方面：酶作为药物作用于人体具有种类多、用量少、纯度高的特点。3.在药物生产方面的应用：利用酶的催化作用将前体物质转化为药物。4.在分析检测方面的应用：是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的。第五页，共29页。白血病的概述与致病因素概述白血病（Leukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆中的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻。特征白细胞呈恶性、无限制地增生，浸润全身各组织和脏器，周围血液血细胞有量和质的变化。抑制红细胞和血小板止血的产生，非常容易受伤、出血、感染。白血病的芽细胞第六页，共29页。白血病的概述与致病因素

对白血病病因的精确原因还在研究中。一般认为，骨髓干细胞内的DNA变异导致它们的恶化。其原因可以是暴露在放射线中、接触致癌物质和其它细胞内遗传物质的变异。病毒也可能导致白血病。致病因素可大致分为四类：病毒因素：

已证实C型RNA肿瘤病毒或逆转录病毒是导致哺乳类动物自发性白血病的病因。这种病毒能通过内生的逆转录酶按照RNA顺序合成DNA的复制品，即前病毒，当其插入宿主的染色体DNA中后可诱发恶变。第七页，共29页。白血病的概述与致病因素化学因素：

一些化学物质有致白血病的作用。如接触苯及其衍生物的人群白血病发生率高于一般人群。放射因素：

包括X射线、r射线。有确实证据可以肯定各种电离辐射条件可以引起人类白血病。白血病的发生取决于人体吸收辐射的剂量，整个身体或部分躯体受到中等剂量或大剂量辐射后都可诱发白血病。然而，小剂量的辐射能否引起白血病，仍不确定。遗传因素：

近亲结婚人群急性淋巴细胞白血病的发病率比期望值高30倍。某些染色体有畸变、断裂的遗传性疾患常伴有较高的白血病发病率，如Down综合征、先天性血管扩张红斑症（Bloom综合征）和Fanconi贫血等。第八页，共29页。白血病的发病率

根据国外统计，白血病约占肿瘤总发病率的3%左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。白血病的发病率在世界各国中，欧洲和北美发病率最高，其死亡率为万人口。亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为万人口。男性发病率略高于女性（1．81：1）。成人急性白血病中以急性粒细胞白血病最多见。儿童中以急淋白血病较多见。慢粒白血病随年龄增长而发病率逐渐升高白血病的概述与致病因素第九页，共29页。一、L-天冬氨酰胺酶的性质

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP），广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中，纯酶的分子量从130000到140000不等。物理性状为白色结晶粉末，微有湿性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有机溶剂。对热稳定性好，在温度50℃下，15min后，活性降低30%，60℃下，1小时内失活。冻干品在2~5℃可稳定数月，但其溶液只能保存数日，20℃储存7天，5℃储存14天均不减少酶的活力。最适宜在pH值为8.5，温度在37℃下储存。L-天冬酰胺酶第十页，共29页。二、L-天冬酰胺酶的结构L-天冬酰胺酶第十一页，共29页。二、L-天冬酰胺酶的结构L-天冬酰胺酶第十二页，共29页。二、L-天冬酰胺酶的结构L-ASP结构中与催化活性相关位点的研究

L-ASP用于临床以来，人们对其分子结构与催化活性间的关系进行深入的研究。L-ASP结果中已经被研究过的位点包括T12、Y25、S58、T89、N248等，L-ASP的活性中心由T12、Y25、S58、T89、D90。L-天冬酰胺酶E.

coliL-ASPII的活性中心第十三页，共29页。三、L-天冬氨酰胺酶的功能L-天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，为抗肿瘤酶制剂。肿瘤细胞因不能合成生长必需的天冬酰胺而使其生长受到限制。正常细胞能合成天冬酰胺，故受影响较少。因此，天冬酰胺酶是一种对肿瘤细胞有选择性的抑制药物。对急性淋巴细胞白血病的缓解率在50%以上，对急性粒细胞性白血病和急性单核细胞白血病有一定疗效，缺点是单独使用不仅缓解期短，切易产生耐药性。该药对肌体免疫也有抑制作用，它还可用于治疗皮肌炎。在动物实验中，本品对实体瘤和白血病均有效，且与常见巯嘌呤、甲蝶呤、长春新碱、阿糖胞苷等无交叉耐药现象。L-天冬酰胺酶第十四页，共29页。一、L-天冬酰胺酶的修饰

1、微囊化修饰

将L-天冬酰胺酶用半透膜性质的聚合物制成微囊型固定化酶。其大小一般为1～500Lm。低分子底物可以自由出入胶囊膜,与酶接触而起反应,反应产物则因浓度不断增加而不断渗透出胶囊外面。囊型固定化可以克服天然酶针剂出现的抗体抗原反应。该固定化酶注射到人体后,对膜具有良好通透性的低分子底物能长时间发挥作用,比天然酶的疗效好,而且急性毒副反应也较低。L-天冬酰胺酶的修饰及作用机制第十五页，共29页。

2、L-天冬酰胺酶的聚乙二醇化

L-ASP的聚乙二醇化不但降级了胰蛋白酶对它的降解作用，而且修饰酶的抗原性与天然酶相比也大为下降。此外，聚乙二醇化L-ASP与传统的脂质体化L-ASP相比与有明显的优势。L-天冬酰胺酶的修饰及其作用机制第十六页，共29页。L-天冬酰胺酶的修饰及作用机制二、L-天冬酰胺酶的作用机制

当L-天冬酰胺酶注射进入人体后，人体正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质合成不受影响。而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说，由于本身不能合成L-天冬酰胺，外来的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此蛋白质合成受阻，从而导致癌细胞死亡。对治疗白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶是第一种用于治疗癌症的酶。第十七页，共29页。L-天冬酰胺酶的抗肿瘤作用：

L-ASP抗肿瘤的作用机制在于它能降低人体内L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的浓度，这两种氨基酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细胞缺乏天冬氨酰合成酶，不能合成L-天冬酰胺，需要摄取外源L-天冬酰胺才能存活。当外源L-天冬酰胺被分解掉时，癌细胞合成核苷酸和戴白骓·蛋白质的能力就会显著降低，因此L-ASP能有效的抑制肿瘤细胞的增值。

L-天冬酰胺酶的修饰及作用机制第十八页，共29页。L-天冬酰胺酶的生产工艺

L-天冬氨酰酶最初是从豚鼠的血清中提取出来的，含量很低，后来改为发酵的方式发酵生产。采用大肠杆菌、欧文菌以及粘质赛氏等产生菌制备。大肠杆菌产生的天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶Ⅰ和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶Ⅰ的亲和力很小，没有抗癌活性，存在于细胞质中，而具有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分布于细胞周质中。因此，生产上常用大肠杆菌作为L-天冬酰胺酶的生产原料。第十九页，共29页。L天冬酰胺酶的生产工艺材料与试剂

大肠杆菌；培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g37℃；玉米浆30kg；（NH4)2SO4蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5)（NH4)2SO450mmol/L,不同PH值的磷酸缓冲液丙酮第二十页，共29页。天冬酰胺酶工艺流程图

大肠杆菌→肉汤菌种→种子菌种→发酵液→菌体→提取液→上清液→沉淀→洗脱液→洗脱液→冻干→

L-天冬酰胺酶[菌种培养]肉汤培养基37℃48h玉米浆培养基37℃4-8h[种子培养][发酵]玉米浆培养基37℃6-8h[离心][提取]蔗糖抽提液PH7.530℃

[分级沉淀]（NH4)2SO455％饱和度PH7.0[分级沉淀]（NH4)2SO490％饱和度[离子沉淀]DEAE-纤维素(DE52)[离子交换]CM-纤维素(CM52)L-天冬酰胺酶的生产工艺第二十一页，共29页。工艺过程及要点1菌种培养

采用大肠杆菌EscherichiacoliA.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g37℃,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。

2种子培养

培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，37℃，通气搅拌培养4-8h.L-天冬酰胺酶的生产工艺第二十二页，共29页。一、总述3发酵罐培养取玉米浆100Kg，接种量8%，37℃，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。4蔗糖溶液抽提将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30℃振荡2h,8000r/min离心，收取上层酶液。L-天冬酰胺酶的生产工艺第二十三页，共29页。5硫酸铵分级沉淀

取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%饱和度，调PH至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%饱和度，离心收集沉淀。6L-天冬酰胺酶的分离纯化

将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用10mmol/L，PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱（1cm×30cm）,用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分，再调整PH4.8,通过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱（1cm×8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220U/mg蛋白。L-天冬酰胺酶的生产工艺第二十四页，共29页。

Erwinase获准用于治疗对大肠杆菌源性天冬酰胺酶过敏的急性淋巴细胞性白血病患者2011年11月18日，EUSA制药和美国食品药品管理局(FDA)宣布孤儿药Erwinase获准用于治疗对大肠杆菌源性的天冬酰胺酶有超敏反应的急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者。

Erwinaze是一种可降低循环血液中天门冬酰胺水平的天冬酰胺酶。天门冬酰胺是细胞生长的必需氨基酸，将其从血液中清除可抑制ALL相关细胞的生长。天冬酰胺酶产品来源于细菌，近15%~20%的患者可对大肠杆菌源性的现代制剂产生超敏反应因而无法持续治疗。Erwinaze是由欧文氏菌产生的，在免疫学性质上有别于原有的制剂，适用于对大肠杆菌源性治疗有超敏反应的患者。

FDA批准Erwinase是基于相关的多项临床试验结果，共涉及630例ALL患者。在一项纳入58名受试者的关键性疗效研究中，100%的可评估患者达到了天冬酰胺酶活性主要终点。Erwinaze的不良反应：过敏反应、胰腺炎、转氨酶和胆红素水平升高、血栓形成、出血、高血糖症、恶心和呕吐。

L-天冬酰胺酶在医药领域的进展

1、Erwinase获准用于治疗对大肠杆菌源性天冬酰胺酶过敏的急性淋巴细胞性白血病患者第二十五页，共29页。

2、静脉注射天冬酰胺酶对于55岁左右新诊断急性成淋巴细胞白血病诱导缓解期治疗的药效动力学以及安全性

与儿童相比，天冬酰胺酶成人治疗的药代动力学、药效学以及安全性信息非常有限。研究人员采用单次静脉注射天门冬酰胺酶(2000IU/m(2))作为25例成人患者诱导缓解的线药物，并在几个时间点获得血清样本。结果可见，天门冬酰胺酶活性血清峰浓度的总体均值为1IU/ml，消除半衰期为7天，分布容积为2.43L/m(2)。单剂量给药后，患者2小时后完全去氨基，并分别在14、21和28天完成100%、81%和44%。药效动力学相关模型显示，0.2IU/ml的最小酶活性最适天门冬酰胺酶消除。动态的POSTHOC分析显示酶活性可以持续3个星期或更长。1例患者在给药后22天产生了抗天门冬酰胺酶抗体。天门冬酰胺酶耐