农杆菌介导法转BT毒蛋白樱桃的初步研究

基因工程课题设计课题名称：农杆菌介导法转BT毒蛋白樱桃的初步研究班级：姓名：学号：课题基本信息研究课题摘要研究目标、内容、方法及意义Bt毒蛋白基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因,已经被转入多种作物中。其中,棉花、玉米、马铃薯等转Bt毒蛋白基因抗虫作物已经商品化生产,创造了可观的经济效益。结合转Bt毒蛋白基因技术的成熟以及转Bt毒蛋白基因抗虫作物的培育现状,以及樱桃易受虫害危害的事实，主要研究运用农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因转入樱桃中，以获得转Bt毒蛋白的抗虫樱桃。以此提高樱桃的产量及减少农药对人体的危害。同时降低樱桃昂贵的价格，使樱桃成为广大消费者食用的佳品。课题研究目的和意义虫害是制约农作物高产的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。而通过基因工程手段培育抗虫新品种可从根本上解决问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染。人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，其中棉花、玉米、马铃薯等转Bt毒蛋白基因抗虫作物已经商品化生产,创造了可观的经济效益。樱桃属于蔷薇科落叶乔木果树，我国华东和河北、山西、河南、湖北、四川等地均有栽培，夏初果实成熟时采收，洗净鲜用。樱桃医疗保健价值颇高。樱桃味甘微酸，入脾、肝经。补中益气，祛风胜湿，主水谷痢，止泄精。主治病后体虚气弱，气短心悸，倦怠食少，咽干口渴，及风湿腰腿疼痛，四肢不仁，关节屈伸不利，冻疮等病症。常食樱桃可补充体内对铁元素量的需求，促进血红蛋白再生，既可防治缺铁性贫血，又可增强体质，健脑益智。给小儿饮用樱桃汁能够预防感染麻疹。樱桃核则具有发汗透疹解毒的作用。樱桃可祛风胜湿、杀虫樱桃性温热，兼具补中益气之功，能祛风除湿，对风湿腰腿疼痛有良效。樱桃树根还具有很强的驱虫、杀虫作用，可驱杀蛔虫、蛲虫、绦虫等。樱桃可以治疗烧烫伤，起到收敛止痛，防止伤处起泡化脓的作用。同时樱桃还能治疗轻、重度冻伤。樱桃所含蛋白质、糖、磷、胡萝卜素、维生素C等均比苹果、梨高，尤其含铁量高，常用樱桃汁涂擦面部及皱纹处，能使面部皮肤红润嫩白，去皱消斑。在水果家族中，一般铁的含量较低，樱桃却卓然不群，一枝独秀：每百克樱桃中含铁量多达59毫克，居于水果首位；维生素A含量比葡萄、苹果、橘子多4～5倍。2.含糖、枸椽酸、酒石酸、胡萝卜素、维生素C、铁、钙、磷等成分。樱桃的栽培过程中，喷洒了大量的农药和其他化学物质，其残留的农药和化学物质在人食用之后会对人体造成巨大的危害。樱桃的栽培过程中主要害虫有介壳虫、卷叶蛾、绿盲蝽、梨小食心虫、金龟子、梨花网蝽（梨军配虫）、象甲、叶螨（山楂叶螨、二斑叶螨等）、叶蝉等。而且对樱桃树的用药也分为地面处理用药和树上用药，不仅造成农药残留，还会造成土壤和水源的污染和环境的破坏。随着现代分子生物技术的发展，我们拥有了将樱桃树转基因的条件。拥有了新的方法来减少樱桃所遭受的虫害，即转Bt基因樱桃。转Bt基因樱桃是将人工分离和修饰过的Bt毒蛋白基因导入到樱桃树基因组中。我们主要是将苏云金芽孢杆菌中可以产生杀虫晶体蛋白的基因片段导入樱桃树生殖细胞，并将其培育成成熟植株。，使这些樱桃树具有杀虫能力。苏云金芽孢杆菌是一种分布广泛的革兰氏阳性土壤细菌，在形成芽孢的同时会在菌体的一端或两端形成伴孢晶体，即杀虫晶体蛋白。伴孢晶体被敏感昆虫幼虫吞食后，在肠道碱性环境和蛋白酶作用下释放出的毒性肽与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合形成离子通道，破坏细胞渗透平衡，使细胞肿胀破裂，最终导致昆虫死亡。其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和膜翅目等多种重要的农林业害虫都具毒杀作用。国内外同类研究现状、水平及发展趋势泰国农业大学的AnonThammasittirong和TipvadeeAttathom通过PCR技术，检测了泰国当地的苏云金芽孢杆菌中杀虫晶体蛋白基因。这篇文献中，两位科学家运用PCR技术对泰国不同地区，不同生态环境的134种苏云金芽孢杆菌菌群进行了杀虫晶体蛋白基因序列的检测。并将得到的结果与前人所做的进行了对比。两位科学家先将菌株在37摄氏度条件下，在天然培养基琼脂平板上培养16小时。然后将一环菌体转移到3ml的LB培养基中，震荡培养一夜。之后将其两次离心，上清液加入到苯酚中再进行离心。再经过氯仿、乙醇、TE缓冲液等的处理，最后得到进行PCR测定需要的DNA。由前人研究已知基因Cry1,Cry2和Cry9对产生特异性杀死鳞翅目昆虫的晶体蛋白是必须的。通过PCR检测，分析得到的三种基因的分布频率与其他的研究相比较多。两位科学家分析认为这是由于他们使用的探针不同所致。研究结果还得到了基因Cry1的不同亚型的分布频率。以及基因Cry2的分布频率，并发现，其在各个地区的分布频率都很高。除此之外，许多因素都会影响Bt蛋白。例如，扬州大学园艺与植物保护学院的徐健、刘琴、谭永安和祝树德研究了粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌的增效特性及对Bt毒蛋白的降解活化作用。许多作物，例如小麦、甘薯、谷子、花生等，都通过导入Bt蛋白基因来提高抗虫性。其中玉米是应用转基因技术较早的作物之一。玉米是世界三大粮食作物之一，也是重要的饲料及工业原料作物。据统计，全世界有玉米害虫约350种，其中以鳞翅目害虫一玉米螟分布最广泛、危害最严重，是玉米产量和品质的重要影响因素。在中国，玉米螟在全国各玉米产区均有不同程度的发生，常年发生面积达一千三百多万公顷，一般年份减产lO％～30％，严重时减产超过50％，危害损失五十多亿千克。近年来，随着玉米种植面积的扩大，加之全球气候变暖，玉米螟安全越冬基数增高，导致玉米螟发生呈加重趋势。由于这种情况，1990年，美国孟山都公司和迪卡公司开始研究转基因玉米。1993年，Koziel等人工合成了一个G+C含量达到65％的结构基因(与野生型CryL4(6)基因的同源性为65％)，利用基因枪技术把该合成基因导入玉米品种，获得2个转基因玉米品系能够抵御欧洲玉米蜞在生长季节的反复危害。1996年抗虫转基因玉米开始进入商业化生产阶段，2021年即有3种转Bt毒蛋白基因玉米在美国进行商业化生产。转基因玉米商业化生产以来，全球共有17个国家种植转基因玉米，其中有7个欧盟国家正式商业化种植抗虫Bt玉米。国内在抗虫转基因玉米研究方面虽然起步较晚，但进展较快。目前，国内外转胁毒蛋白基因玉米的主要转化方法有：基因枪法、农杆菌介导法、子房注射法、花粉介导法超声波法等。基因枪法又称粒子轰击，高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。国内外许多科学家已经运用这种方法成功的将Bt蛋白基因导入玉米中。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。农杆菌有这样的作用是由于它的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。随着转Bt毒蛋白基因作物的大规模种植，许多人开始担心它对人类及生态环境的影响。许多人质疑，在杀死昆虫的同时，对人也会产生毒性。我认为，由导入基因产生的毒蛋白对人是基本无害的。Bt杀虫晶体蛋白被敏感昆虫取食后，在昆虫中肠碱性和还原性条件下，溶解为前毒素，然后被蛋白酶水解为抗酶活性毒素分子，该活性毒素分子可与中肠上皮细胞纹缘膜上特异受体结合，插入膜内使细胞膜穿孔，破坏消化道细胞的离子、渗透压平衡，最终导致昆虫死亡。而这种酶在人体内是没有的。美国国家科学、工程和医学学院也发布了一份大型报告，试图回答一些转基因领域“令人困惑的”问题。这份得到学术界赞许的报告再次确认，转基因食品对健康无不利影响，可安全食用。但同时认为，转基因技术不像支持者所宣称的那样有助提高粮食增产率。这份报告指出，从上世纪80年代开始，基因工程技术被应用于使植物产生特定的特性，如延长水果保存时间、提高食品维生素含量或增强作物抗病能力等，但只有两种转基因特性得到广泛的商业应用，即抗除草剂与抗虫害。今天最广泛种植的转基因作物主要有3种，分别是大豆、棉花和玉米。参考文献：植物抗虫基因工程的研究进展李海燕，朱延明，马凤鸣解读最新美国转基因报告新华社三、课题研究采用的主要方法和技术路线（一）主要研究内容1、Bt毒蛋白基因的提取:提取方法：TritonX-IO0温和裂解法。提取苏云芽孢杆菌质粒上的编码Bt毒蛋白基因。这种Bt毒蛋白基因位于质粒DNA上，苏云金杆菌质粒DNA含量极其丰富(从1.5MD到大于130MD)，组成极其多样化，不仅不同变种间而且同一变种不同菌株间，其质粒组成也不同，所以Bt质粒DNA的提取一直是实验中较难解决的问题．以往多采用碱裂解法和SDS裂解法，但在质粒DNA质量和产量、实验重复性等方面有一些缺陷。改进的TritonX-IO0温和裂解法提取Bt质粒DNA，取得较理想的效果。菌株:苏云芽孢杆菌试剂：提取质粒DNA所用试剂为国产分析纯；RNase；DNAmolecularweightMarker。仪器：离心机。苏云金杆菌质粒DNA的提取：将苏云金杆菌株接种在LB平板上，培养16～18h后，取单菌落于3mlLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。取培养液于Ep管中。以4000r/min离心5min，去掉上清液；加入100ul的TES洗涤菌体，以4000r/min离心2min，弃上清液。LB：胰化蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%。TES：50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，50mmol/LNaCl，pH8.0。TritonX-100裂解法提取质粒DNA于Ep管内加入100ul的溶液A，37℃水溶6Omin；加入溶液B，37℃水浴90min，每隔30min摇匀一次；加入40ul的5mmol/LNaC1，混匀，室温放置2min；用等体积饱和酚连续抽取3次，再用酚、氯仿1和氯仿2各抽取一次；离心弃上清液，加两倍体积无水乙醇沉淀，-2O℃放置1h，离心，再用70％乙醇洗涤，真空抽干，即得质粒DNA；用2OulTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，DH80)缓冲液溶解质粒DNA后，于-20℃保存备用。溶液A：5mg/mlLysozyme，100ug/mlRNase溶于TES。溶液B：0.6％TritonX—100，50mmol/LTris-HCl，pH8.0，10mmol／LEDTA，100ug/LPronaseK.Bt毒蛋白基因表达载体的构建：酶和生化试剂：表达载体质粒pBI121；限制性内切酶BamHI和SacI，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，其他生化试剂均为分析纯。基因引物：Primer1：5′一AACAGTGCCCTFACAACC一3′Primer2：5′一TCCCGTCAAGAACAGATAG一3′主要仪器：离心机，恒温水浴摇床，PCR仪，紫外分光光度计，电泳仪。Bt基因的克隆及测序：将Bt基因和载体质粒pBI121用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，把切下来的基因与测序载体用T4DNA连接酶在4℃下连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂平板后挑单菌落提取质粒。提取质粒后，分别酶切回收胁Bt基因和去掉gus基因的片断，然后用T4连接酶连接。酶切体系为质粒3.0uL，0.5×kBuffer(10×)3.0uL，SacI0.5uL，BamHI0.5uL，ddH₂O13.0uL，总体积20．0uL，37℃保温4h。连接体系为Bt基因片断10.0uI，载体质粒pBI121(去除gus基因)片断2.0uL，T4DNA连接酶1.0uL，T4buffer(10×)2.0uL，ddH₂O5.0L，总体积20.0uI，4℃连接过夜。将重组质粒pBI121—Bt转化到大肠杆菌中，用PCR方法和酶切检测。PCR反应条件为ddH₂O15.0uL，buffer2．5uL，Mg²+2.0uL，dNTP2.0uL，Primerl1.0uL，Primer21.0uL，TagDNA0.5uL，模板1.0uL，总体积25.0ulPCR反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性1min．53℃复性1min，72℃延伸2．5min，循环30次，72℃保温5min，0.8％琼脂糖凝胶电泳。采用冻融法将含有pBI121—Bt的大肠杆菌转化到根癌农杆菌中。载体pBll21-Bt基因的构建3、受体材料的准备：樱桃叶片愈伤组织的诱导：将樱桃幼嫩的叶片切下，其边长为3CM的正方形一块,用75%乙醇灭菌5min,再用2.5%的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min,37min,30min和25min),以确定最佳灭菌时间,灭菌后用无菌水冲洗6～8次,于MS固体培养基上28℃避光培养,8天、10天。12天、14天依次查看愈伤组织生长情况。将愈伤组织进行继代培养,得到胚性愈伤组织。4、转化樱桃叶愈伤组织：材料：含Bt基因的根癌农杆菌,樱桃胚性愈伤组织步骤：用AB固体培养基+氯霉素25mg/L+利福平20mg/L+AS20mg/L培养农杆菌,在20℃下培养5～6d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌,放入AAM液体培养基中(加有2mg/L2,4-D,0.7g/L脯氨酸,20mg/LAS),在80rpm/min,27℃下,摇荡培养4h。将挑好的樱桃叶胚性愈伤组织放入锥形瓶,菌液倒入另一锥形瓶中,并加入AAM培养基(+AS50mg/L),分别调节浓度(0.120、0.145、0.158、0.190、0.195),以确定最佳的农杆菌浓度。然后将菌液倒入愈伤组织中,用手轻摇,感染15min。再吸干菌液,将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥,移至共培养基上27℃下共培养。转化体的获得：3-5天后，将共培养的愈伤组织转出,无菌水漂洗3～4次,再用NB培养基+50mg/L头孢霉素在室温下100rpm摇洗1～2h,洗2遍后吸干放在滤纸上。将吸干的愈伤组织转入N6选择培养基上(+50mg/L潮霉素+500mg/L头孢霉素),27℃下暗培养15-20d后,继代一次。将新长出的抗性愈伤组织转移到N6预分化培养基上，28℃下,暗培养7d。将抗性愈伤组织转移到N6分化培养基上,28℃下,光照12h/d,培养2～3周后,新鲜愈伤组织将有绿点出现,每2周继代一次,待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中。检测幼苗Bt蛋白含有量，筛选出成功转入Bt毒蛋白基因的樱桃幼苗。炼苗并移栽：保护地育苗的情况下，采取：放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼。炼苗在定植前5-7天进行，不可时间过长。炼苗的主要方法有：停止加温，放风降温，将玻璃温室的放风口全部打开，塑料温室拱棚的上下放风口揭开。定植前2—3天，在无霜的情况下，撤走全部覆盖物，打开所有通风口，减浇水量，在不萎蔫的情况下尽量减少浇水。炼苗后将转基因的樱桃树移栽至合适的土地里栽培。参考文献：一种改进的提取苏云金杆菌质粒DNA的方法，刘全兰、张何、陈宇、夏立秋，湖南师范大学Bt基因的克隆及植物表达载体的构建，于守江、王超，东北农业大学园艺学院农杆菌介导法，转基因技术原理及要点，李琳玲搜狗百科（二）技术路线如下：BtBt基因分离提取Bt毒蛋白基因表达载体的构建樱桃叶愈伤组织的准备樱桃叶愈伤组织遗传转化樱桃叶转化组织转化组织脱分化转化植株筛选炼苗移栽

咖啡店创业计划书第一部分：背景在中国，人们越来越爱喝咖啡。随之而来的咖啡文化充满生活的每个时刻。无论在家里、还是在办公室或各种社交场合，人们都在品着咖啡。咖啡逐渐与时尚、现代生活联系在一齐。遍布各地的咖啡屋成为人们交谈、听音乐、休息的好地方，咖啡丰富着我们的生活，也缩短了你我之间的距离，咖啡逐渐发展为一种文化。随着咖啡这一有着悠久历史饮品的广为人知，咖啡正在被越来越多的中国人所理解。第二部分：项目介绍第三部分：创业优势目前大学校园的这片市场还是空白，竞争压力小。而且前期投资也不是很高，此刻国家鼓励大学生毕业后自主创业，有一系列的优惠政策以及贷款支持。再者大学生往往对未来充满期望，他们有着年轻的血液、蓬勃的朝气，以及初生牛犊不怕虎的精神，而这些都是一个创业者就应具备的素质。大学生在学校里学到了很多理论性的东西，有着较高层次的技术优势，现代大学生有创新精神，有对传统观念和传统行业挑战的信心和欲望，而这种创新精神也往往造就了大学生创业的动力源泉，成为成功创业的精神基础。大学生创业的最大好处在于能提高自己的潜力、增长经验，以及学以致用;最大的诱人之处是透过成功创业，能够实现自己的理想，证明自己的价值。第四部分：预算1、咖啡店店面费用咖啡店店面是租赁建筑物。与建筑物业主经过协商，以合同形式达成房屋租赁协议。协议资料包括房屋地址、面积、结构、使用年限、租赁费用、支付费用方法等。租赁的优点是投资少、回收期限短。预算10-15平米店面，启动费用大约在9-12万元。2、装修设计费用咖啡店的满座率、桌面的周转率以及气候、节日等因素对收益影响较大。咖啡馆的消费却相对较高，主要针对的也是学生人群，咖啡店布局、格调及采用何种材料和咖啡店效果图、平面图、施工图的设计费用，大约6000元左右3、装修、装饰费用具体费用包括以下几种。(1)外墙装饰费用。包括招牌、墙面、装饰费用。(2)店内装修费用。包括天花板、油漆、装饰费用，木工、等费用。(3)其他装修材料的费用。玻璃、地板、灯具、人工费用也应计算在内。整体预算按标准装修费用为360元/平米，装修费用共360*15=5400元。4、设备设施购买费用具体设备主要有以下种类。(1)沙发、桌、椅、货架。共计2250元(2)音响系统。共计450(3)吧台所用的烹饪设备、储存设备、洗涤设备、加工保温设备。共计600(4)产品制造使用所需的吧台、咖啡杯、冲茶器、各种小碟等。共计300净水机，采用美的品牌，这种净水器每一天能生产12l纯净水，每一天销售咖啡及其他饮料100至200杯，价格大约在人民币1200元上下。咖啡机，咖啡机选取的是电控半自动咖啡机，咖啡机的报价此刻就应在人民币350元左右，加上另外的附件也不会超过1200元。磨豆机，价格在330―480元之间。冰砂机，价格大约是400元一台，有点要说明的是，最好是买两台，不然夏天也许会不够用。制冰机，从制冰量上来说，一般是要留有富余。款制冰机每一天的制冰量是12kg。价格稍高550元，质量较好，所以能够用很多年，这么算来也是比较合算的。5、首次备货费用包括购买常用物品及低值易耗品，吧台用各种咖啡豆、奶、茶、水果、冰淇淋等的费用。大约1000元6、开业费用开业费用主要包括以下几种。(1)营业执照办理费、登记费、保险费;预计3000元(2)营销广告费用;预计450元7、周转金开业初期，咖啡店要准备必须量的流动资金，主要用于咖啡店开业初期的正常运营。预计2000元共计： 120000+6000+5400+2250+450+600+300+1200+1200+480+400+550+1000+3000+450+2000=145280元第五部分：发展计划1、营业额计划那里的营业额是指咖啡店日常营业收入的多少。在拟定营业额目标时，必须要依据目前市场的状况，再思考到咖啡店的经营方向以及当前的物价情形，予以综合衡量。按照目前流动人口以及人们对咖啡的喜好预计每一天的营业额为400-800，根据淡旺季的不同可能上下浮动2、采购计划依据拟订的商品计划，实际展开采购作业时，为使采购资金得到有效运用以及商品构成达成平衡，务必针对设定的商品资料排定采购计划。透过营业额计划、商品计划与采购计划的确立，我们不难了解，一家咖啡店为了营业目标的达成，同时有效地完成商品构成与灵活地运用采购资金，各项基本的计划是不可或缺的。当一家咖啡店设定了营业计划、商品计划及采购计划之后，即可依照设定的采购金额进行商品的采购。经过进货手续检验、标价之后，即可写在菜单上。之后务必思考的事情，就是如何有效地将这些商品销售出去。3、人员计划为了到达设定的经营目标，经营者务必对人员的任用与工作的分派有一个明确的计划。有效利用人力资源，开展人员培训，都是我们务必思考的。4、经费计划经营经费的分派是管理的重点工作。通常能够将咖啡店经营经费分为人事类费用(薪资、伙食费、奖金等)、设备类费用(修缮费、折旧、租金等)、维持类费用(水电费、消耗品费、事务费、杂费等)和营业类费用(广告宣传费、包装费、营业税等)。还能够依其性质划分成固定费用与变动费用。我们要针对过去的实际业绩设定可能增加的经费幅度。5、财务计划财务计划中的损益计划最能反映全店的经营成果。咖啡店经营者在营运资金的收支上要进行控制，以便做到经营资金合理的调派与运用。总之，以上所列的六项基本计划(营业额、商品采购、销售促进、人员、经费、财务)是咖啡店管理不可或缺的。当然，有一些咖啡店为求管理上更深入，也能够配合工作实际需要制订一些其他辅助性计划。第六部分：市场分析2019-2021年中国咖啡市场经历了高速增长的阶段，在此期间咖啡市场总体销