微生物检测技术

微生物的分离、纯化与接种技术接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

第一页，共29页。微生物的分离、纯化与接种技术划线接种：这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。第二页，共29页。划线接种，分离纯化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies第三页，共29页。灼烧第四页，共29页。第五页，共29页。微生物的分离、纯化与接种技术斜面接种技术第六页，共29页。微生物的分离、纯化与接种技术

－－细菌的涂布分离技术第七页，共29页。微生物的分离、纯化与接种技术

－－液体接种法、穿刺接种液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。第八页，共29页。微生物的培养

－－微生物培养中的氧气条件培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。第九页，共29页。微生物的培养

－－微生物培养中的厌氧条件生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。第十页，共29页。微生物的培养

－－微生物培养中的厌氧培养美兰氧化还原指示剂：0.006NNaOH0.015%美兰溶液6％葡萄糖溶液上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。第十一页，共29页。细菌生理学检查法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。

缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。2.按土：砂＝1：4的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，160～1700C干热灭菌2h。3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。第十二页，共29页。细菌生理学检查法

－－微生物生化反应生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。糖酵解试验淀粉水解试验V-P试验甲基红（MethylRed）试验靛基质（Imdole）试验枸椽酸盐试验：尿素酶（Urease）试验三糖铁（TSI）琼脂试验第十三页，共29页。细菌生理学检查法

－－糖酵解试验

不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。第十四页，共29页。细菌生理学检查法

－－淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。第十五页，共29页。细菌生理学检查法

－－乙酰甲基甲醇（V-P）试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。第十六页，共29页。细菌生理学检查法

－－甲基红（MR）试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。第十七页，共29页。细菌生理学检查法

－－靛基质（吲哚）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。第十八页，共29页。细菌生理学检查法

－－柠檬酸盐试验某些细菌能利用柠檬酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。第十九页，共29页。细菌生理学检查法

－－尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。1、未接种2、尿素酶阳性3、尿素酶阴性第二十页，共29页。细菌生理学检查法

－－三糖铁（TSI）琼脂试验

本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

第二十一页，共29页。细菌生理学检查法

－－沙门氏菌的TSI试验第二十二页，共29页。食品卫生细菌学一般检验技术

食品卫生细菌学检验的目的，是要对食品进行细菌卫生评价。这就要求检验人员在求实的精神下，科学地进行被检对象的采样、样品送检、检样处理、检验以及报告。在整个过程中，不得掺杂检验人员的丝毫主观臆想和工作上的马虎，要有章可依地进行检验和报告。样品的采样→送检→样品的处理→检验与报告

第二十三页，共29页。食品微生物检样的采集样品种类样品可分大样、中样、小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品各部分取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样及散装食品均采样250g；小样系指分析用的样品，又称为检样，检样一般为25g。采样的方法根据样品，如袋装、瓶装或罐装食品，应采用完整的未开封的样品；检样是冷冻食品，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱保存），非冷冻食品需在0～5℃中保存。（1）液体样品的采样：将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，放入无菌容器。（2）半固体样品的采样：无菌操作开启包装，用灭菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。（3）固体样品的采样：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应兼顾表面和深度，注意样品代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。样品是固体粉末，应边取样边混合。第二十四页，共29页。食品微生物检样的采集

（4）冷冻食品的采样：大包装小块冷冻食品的采样按小块个体采取；大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。（5）生产工序监测采样车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检。第二十五页，共29页。食品微生物检样的采集采样的数量采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日）取样注意事项：防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触；取样的操作要规范、迅速（无菌操作）；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏）取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法采样所出的问题第二十六页，共29页。食品微生物检验的样品送检采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的减少或增多。无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微生物进一步污染；进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途遥远