分子生物学常用实验技术概述

分子生物学常用实验技术概述第1页，共26页，2023年，2月20日，星期三分子杂交技术利用单链核苷酸碱基互补配对；抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广泛用于基因重组、生物印迹示踪、生物芯片等领域，具有高特异性、高灵敏度、高通量等特点的技术。第2页，共26页，2023年，2月20日，星期三核酸杂交(nucleicacidhybridization)DNA的变性(Denaturation)

：维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂，DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象复性：变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。核酸分子杂交：指具有一定互补序列不同来源的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异源双链的过程。第3页，共26页，2023年，2月20日，星期三核酸杂交核酸杂交探针(probe)：能够与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。Southernblot:通过限制性核酸内切酶降解样本中DNA，再经凝胶电泳分离、转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行检测的方法。用于基因组DNA特异性序列定位、检测目标DNA。Northernblot:应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术。用于研究特异性mRNA分子在细胞处于不同条件下发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。第4页，共26页，2023年，2月20日，星期三Southernblot第5页，共26页，2023年，2月20日，星期三蛋白质印迹-Westernblot将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，对不同分子量的蛋白质进行分离，再将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标记的二抗(HRP/AP)，经过底物显色或放射自显影，检测被检生物样本中目的基因蛋白表达情况第6页，共26页，2023年，2月20日，星期三Westernblot第7页，共26页，2023年，2月20日，星期三三种印迹技术的比较第8页，共26页，2023年，2月20日，星期三原位杂交(insituhybridization,ISH)

将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。第9页，共26页，2023年，2月20日，星期三菌落原位杂交与荧光原位杂交(FISH)第10页，共26页，2023年，2月20日，星期三生物芯片(biochip)将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子列阵，与待测生物样本靶分子杂交，通过检测信号实现快速、高效、高通量样本检测。第11页，共26页，2023年，2月20日，星期三微列阵芯片(microarraychip)基因芯片(DNAmicroarray)：将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上，以此为探针与待测样品中基因杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来实现对靶序列信息的快速检测和分析。蛋白质芯片(proteinmicroarray)：将已知的多肽、蛋白质按微阵列方式固定在微型载体上，利用抗原与抗体、受体与配体、酶与底物、蛋白与其他小分子间相互作用，检测分析多肽、蛋白质的一项技术。第12页，共26页，2023年，2月20日，星期三微列阵芯片(microarraychip)细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、刺激及培养等精确控制，并通过微型化的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研究目的。组织芯片：将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体山所形成的组织微列阵。第13页，共26页，2023年，2月20日，星期三基因芯片第14页，共26页，2023年，2月20日，星期三目的基因制备技术聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)：在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。cDNA文库(cDNAlibrary):某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞内总mRNA，应用逆转录酶逆转录成cDNA，以此构建的重组DNA克隆群。化学合成：序列已知的较短目的基因第15页，共26页，2023年，2月20日，星期三聚合酶链式反应(PCR)原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs为底物，按照半保留复制原理，通过变性、退火、延伸三个步骤不断重复完成新DNA合成。PCR体系的基本成分：模板、特异性引物、热稳定的DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子(Mg2+)、缓冲液、一价阳离子第16页，共26页，2023年，2月20日，星期三PCR的基本步骤变性：双链DNA解离成为单链(94℃)退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（50℃左右）延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的互补链（70℃左右）第17页，共26页，2023年，2月20日，星期三PCR的应用研究—目的基因的扩增、基因克隆；DNA测序；基因功能和表达调控的研究、分析突变诊断—细菌、病毒、寄生虫检测及诊断人类基因组工程—遗传图谱的构建；DNA测序；表达图谱法医—犯罪现场标本分析、亲子鉴定肿瘤—各种肿瘤检测其他……第18页，共26页，2023年，2月20日，星期三cDNA文库基本原理：用Oligo(dT)作为逆转录引物，或使用随机引物，以提取的总mRNA为模板，进行逆转录PCR，合成的cDNA连接到适当的载体，转化后获得包含cDNA的克隆群。基本步骤：(1)提纯获取高质量的mRNA;(2)cDNA第一条链的合成;(3)cDNA第二条链的合成;(4)双链cDNA的修饰;(5)双链cDNA的分子克隆;(6)cDNA文库的扩增;(7)cDNA文库鉴定评价。第19页，共26页，2023年，2月20日，星期三第20页，共26页，2023年，2月20日，星期三cDNA文库的优越性在基因组水平上研究某基因对器官组织和细胞在个体发育中的影响cDNA文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组织基因的制备由于每一个cDNA克隆都包含一种mRNA序列，在筛选中出现假阳性的概率降低为了测定mRNA序列，利用它的cDNA拷贝序列就可以有效分析外显子的基因结构第21页，共26页，2023年，2月20日，星期三化学合成作为核酸分子杂交探针作为测序及PCR的引物制备较小的基因或天然来源不易得到的完整基因或用于改造天然基因作为DNA末端改造中的接头、引入酶切位点用于基因定位及位点专一性改变第22页，共26页，2023年，2月20日，星期三基因敲除技术(Geneknockout)外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。原理与基本操作:(1)ESCs(embryostemcells)的获得;(2)基因载体的构建;(3)目的基因导入;(4)同源重组ESC的筛选;(5)靶细胞导入小鼠体内;(6)表型研究;(7)得到纯合体第23页，共26页，2023年，2月20日，星期三基因敲除小鼠的产生原理第24页，共26页，2023年，2月20日，星期三RNA干扰技术RAN干扰(RNAinterference,RNAi):外源和内源性双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的技术。RNAi的作用机制:RNA诱导的DNA甲基化：RNA被降解为21-23nt小片段，特异