修饰标记引物的介绍课件

修饰引物的介绍储存条件

冻干引物和稀释成储液的引物建议储存在-20°C.HEX,、TET和FAM对光敏感。应储存在黑暗处或用琥珀色管子储存。推荐放入黑色盒子中。染料

暴露在光下半衰期(大约)HEX4.5hoursTET2.25hoursFAM1.125hoursHEX和TET标记的寡核苷酸在PCR30个循环内都是稳定的；但是在不利的环境中（高PH，高温），TET比HEX稳定。稀释方法对于非Cy类的荧光标记引物，建议用TE稀释，浓度高于10uM。Cy3和Cy5标记的引物在碱性条件下易降解，用中性溶液溶解。修饰对OD值的影响

有些荧光基团在260nm处也有吸收光:这些修饰包括：

FAM,Fluorescein,HEX,TAMRA,andTET。其它在260nm处可能也有吸收值，但是数据没有公布，因此计算时不包括在里面。APandHRP偶联的寡核苷酸:蛋白和核苷酸都有OD值，但是可能不会影响寡核苷酸的真实OD值。合成规模和纯化方式ModSynthPurificationPurificationPurificationPurificationScaleDesaltedCartridgeHPLCGelPurified5'Biotin5'Phosphate5'PrimaryAmine25NYes(10-50bases)NONONO50NYes(10-50bases)NONONO200NYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)5'Rhodamine25NNONONONO50NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)200NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)5'HEX/TET/FAM5'Fluorescein5'GATEWAY25NYes(10-50bases)NONONO50NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)200NNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)APConjugateHRPConjugate**25NNONONONO50NNONONONO200NNONONONO1UNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)Phosphorothioates25NNONONONO50NYes(5-100bases)Yes7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)200NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)25UYesNOYES(7–60bases)YES(7-100bases)合成规模是25nnol时，合成的寡核苷酸不能小于10bp。问题：此表和网站上的不一致，是不是现在在中国不论合成规模大小，都能合成小于10bp的寡核苷酸呢？生物素

生物素修饰能够耐受热和pH（它能被加热到100度并暴露在pH2-10）。其它极端的环境可能也能耐受，但是还没有被检测。还原剂可能不会影响生物素修饰，但是没有精确的数据。生物素寡核苷酸通过OD260进行定量（生物素在260没有吸收光）。

生物素化的DNA能够成功的转化进入细菌，如DH5alpha。

5'-生物素没有相邻烃基，所以它比3'-生物素稳定。

3'-生物素的化学结构可以预测3'-Biotin可能会在两种情况下脱离或降解：1过期，2寡核苷酸暴露在碱性环境中如溶解在碱性缓冲液中。原因是3'-Biotin有类似于RNA结构的相邻的烃基。5’生物素3’生物素问题：生物素dT的分子式？5‘和3’生物素修饰的合成过程（合成后、合成前）？通过什么连接键连接到寡核苷酸上？连接到寡核苷酸的什么位置（戊糖、碱基）？最终连接到寡核酸上的形式生物素罗丹明罗丹明溶解在水或TE中的颜色为粉红色，略成紫色。??罗丹明修饰不受合成规模的限制，它是合成后修饰。需要额外的纯化。??注：这个数据时染料溶解在甲醇中测定得到的。溶解在水或TE中以及与寡核苷酸连接后的值是会变化的。罗丹明问题：现在中国地区能合成的罗丹明修饰有：5‘RhodamineGreen、5’RhodamineRed、5‘RhodamineRed、3’RhodamineRed。RhodamineRed、RhodamineGreen溶解在水中或TE中的颜色？5‘和3’修饰时RhodamineGreen、RhodamineRed的分子结构式？5‘和3’修饰的方法：连接到戊糖还是碱基上？通过什么化学键连接？都是合成后修饰吗？合成后修饰：引物从固体介质上解离之后经过纯化再进行修饰的？还是引物合成之后在固体介质上直接进行修饰？修饰之前需要纯化吗？修饰之后需要纯化吗？最终连接到寡核酸上的形式HEX,TETor6-FAM注：摩尔消光系数是在最大nm处的激发光下测得的。因为pH或成分的微小变化可能会影响以上的数据，

染料的颜色取决于ABI仪器上的“滤光片设备”：DyesFilterAFilterBHEXGreen(560nm)Yellow(560nm)6-FAMBlue(531nm)Blue(531nm)TET-Green(545)问题:3’HEX,TETor6-FAM修饰的结构式？3‘HEX,TETor6-FAM修饰时是连接到戊糖还是碱基上？连接键是什么？3‘HEX,TETor6-FAM是合成后修饰吗？3‘HEX,TETor6-FAM能否进行硫代磷酸化修饰？5‘和3‘修饰的区别，如稳定性等？最终连接到寡核酸上的形式HEX,TETor6-FAM磷酸化5’磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引

物5‘端的糖环上，而不是最后一个碱基上。？？3’磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成的第一个循环，碱基就与它偶联。它能够阻止聚合酶的延伸。稳定性：假设是DNA：3'-PO4比3'-BIO稳定。3'-BIO在碱性环境下会脱落，而3'-PO4不会。用胶纯化磷酸化引物时，不能区分全长引物和n-1引物，因为磷酸基团带阴性电荷，会影响电泳。有些经HPLC纯化后的磷酸化寡核苷酸在真空离心蒸发浓缩后有些“脏”，或微黄。这可能是因为该产物为综合产物。在做QC时，通过乙醇沉淀可以去除。Aminolinker5‘Aminolinker(C6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学反应添加到引物5’糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5‘氨基标准的偶联效率是>95%,氨基基团在260nm处是没有吸光值的；它在210nm处有吸光值。不能通过电泳检测它的存在（琼脂糖或丙烯酰胺）。3'Aminolinker(C7)只与一些5’修饰兼容，如FAM,HEX,TET,Fluorescein,Biotin,Amine,andphosphate。其它的5’修饰(如Alexadyes)需要氨基才能与寡核苷酸相连，这就无法避免该染料与3‘氨基相连。阻止连接或聚合酶延伸的一般想法是末端双脱氧法，但是这种方法昂贵或者不可用。因为只要根据应用去除3‘或者5‘，所以只需用3’或5‘氨基修饰即可满足需要。另外氨基修饰是最简单最便宜的方法。任意一种氨基修饰都可以。5’末端C6类型效果很好。用化学交联剂可以把双链DNA与肽连接。可以尝试用5‘伯胺修饰的DNA与戊二醛进行交联。问题：5‘Aminolinker(C12)、5’Aminolinker(C6)、3‘Aminolinker(C7)、dTC6-Aminolinker、3'Amino/Amine的分子式？3‘Aminolinker(C7)、3'Amino/Amine的修饰过程？连接在核苷酸的什么位置？dTC6-Aminolinker的修饰过程？是不是只能在5‘端用这种修饰？这几种氨基修饰的区别？AminolinkerAlexa

它们都是通过C6连接臂与寡核苷酸连接的。3‘端通过氨基把Alexa连接到引物的3‘端。Alexafluor染料是在合成后添加到寡核苷酸链上的。？？？TexasRed-X修饰基团是怎样被添加到寡核苷酸上的？首先在DNA的5‘末端的磷酸基团上加一个氨基，然后在氨基上连接一个带有羧基的基团。5‘-COOH-NH2-PO3-DNA问题：5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X的结构式？合成过程？合成前修饰还是合成后修饰？5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X通过什么键和寡核苷酸连接？连接到戊糖还是碱基上？水溶液的颜色？5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X的区别Phospothioate(S-oligos)S-oligos是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的。这种修饰是在连接的时候进行的（不是在合成后进行的）。碱基被添加上后，再进行连接修饰。在两个碱基之间的磷酸可以转换成双键“S”（用Beaucage试剂）代替普通的双键“O”（用碘溶液）。最终合成的寡核苷酸不是立体结构单一的形式，它们是R和S立体异构体的混合物。

和磷酸二酯键相连的碱基都可以进行这种修饰。因为从固体支持物上解离下来时，3‘末端碱基是OH，不能进行硫代磷酸化。

我们可以提供对S-oligo进行5‘修饰，如客户可以定制S-oligo的荧光素标记。我们不能提供在保存其它碱基“正常”的情况下使某些位置的碱基硫代磷酸化。这是由于法定原因而不是化学合成的问题。S-oligo和普通的寡核苷酸在胶上的位置是一样的。用HPLC纯化方法纯化硫代磷酸化修饰的寡核苷酸时，带形双峰或者带形很宽。Phospothioate(S-oligos)Phospothioate的特性：化学稳定、在水溶液中稳定、能够抵抗核酸酶应用：磷酸硫代的反义引物在体内通过很多不同的机制起作用。它们可以通过RNA水平抑制逆转录活性（抑制RNA病毒复制）。形成激活RNaseH活性的底物[S-ODNs和RNA形成双链，使RNA更容易被RNaseH切断]。反义寡核苷酸还能够直接干扰转录或抑制翻译。存在于胞内和血液/培养基中的核酸酶对S-Oligos的影响不大。因为S-ODNs保持了寡核苷酸的带电状态，它们能够通过和阳离子脂类形成复合体而进入细胞。它们也存在转染率低的问题。反义引物在mRNA中的作用位点不同时，反义引物起的作用也不同（如寡核苷酸和mRNA上的转录起始密码子互补，敲降效果就很好）。

问题：Phosphorthioate(A/C/G/T)Phospothioate(S-oligos)5‘Aldehyde5‘醛修饰用的化学试剂属于芳香族。它包含苯环。分子量是245。问题：合成过程？合成