产前分子诊断中需要注意的若干问题郑主任修改

产前分子诊断中需要注意的若干问题郑主任修改目录产前诊断，又称宫内诊断或出生前诊断，是对胚胎或胎儿是否患某种严重遗传病或先天性畸形做出准确诊断，以预防患儿的出生，是预防优生学的重要组成部分。一、产前诊断的根本概念〔一〕产前诊断的定义〔一〕产前诊断的意义1.优生的重要措施，减少出生缺陷，进步全民素质4.给孕妇有更大的空间和更多的选择，对于高危孕妇同样可以怀孕并且得到一个安康的小孩5.考虑要保存患病胎儿的孕妇，提供宫内治疗的可行性，提供良好的产前治疗根据一、产前诊断的根本概念筛查/诊断筛查/诊断新生儿筛查筛查/诊断三级预防一级预防二级预防产前孕前植入前一、产前诊断的根本概念出生缺陷的三级预防〔三〕产前诊断的指征35岁以上的高龄孕妇羊水过多的孕妇有原因不明的习惯性流产史的孕妇具有遗传病家族史，或系近亲婚配的孕妇X连锁遗传病基因携带者孕妇夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者；夫妇核型虽正常，但生育过染色体病患儿的孕妇。夫妇之一有开放性神经管畸形，或是生育过这种畸形儿的孕妇夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇一、产前诊断的根本概念〔四〕产前诊断技术产前诊断技术包括两方面：取材技术、实验室检测技术一、产前诊断的根本概念取材技术非侵入性：超声波检查母血胎儿细胞检查

母血胎DNA/RNA检查侵入性：绒毛取样〔孕7-9周〕羊膜腔穿刺〔孕16-20周〕脐带穿刺〔孕20-24周〕胎儿镜检查〔孕18-20周〕

产前诊断检测技术应用范围一、产前诊断的根本概念〔一〕应选择适宜的时期和方法进展染色体相关疾病的产前诊断

二、染色体核型分析孕期12-26+6w＜16w16-22w24-28w样本外周血胎儿DNA绒毛羊水脐带血方法NIPT核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS报告时间10个工作日FISH：1w核型：3wNGS：10个工作日FISH：1w核型：3wNGS：10个工作日FISH：1w核型：3wNGS：10个工作日染色体核型：46，X，del〔X〕〔q25〕〔二〕典型案例分析A：女，36，体格检查未见明显异常二、染色体核型分析染色体核型：45，XY，rob〔13；13〕，-13，-13〔二〕典型案例分析B：男，50，身体安康二、染色体核型分析〔二〕典型案例分析C：刘××，女，表型正常二、染色体核型分析45，XX，rob〔14；21〕〔q10；q10〕

？女方：28岁，孕3产0，胎停育2次，染色体核型：46XX,t〔3;5〕(q25；p15)男方：核型正常孕20周，外院影像学排畸没有发现异常二、染色体核型分析〔三〕多种方法平行使用A——3号和5号染色体平衡异位患者胎儿CNV检测愉快木偶综合征〔快乐天使综合征〕染色体异常：15q11-q13缺失发病率：1/40000临床特征：小头畸形、严重智力障碍、语言障碍、共济失调步态、好动、无意识发笑机制：母源性15q11-q13缺失或UBE3A基因突变二、染色体核型分析〔三〕多种方法穿插使用B——Angelman综合征患儿染色体核型未见异常二、染色体核型分析FISH检测结果示：15q11-q13缺失二、染色体核型分析33岁孕妇，孕24周，46，XN，B超提示胎儿多处软指标异常，表现为胎儿颈后软组织增厚，肠管回声增强，单脐动脉，对培养后的羊水细胞进展了高通量测序染色体异常检测，结果显示：存在1处染色体构造异常：22q11.21-22q11.23存在2.3M缺失，该片段包UBE2L3,YDJC,CCDC116等几十个基因或基因片段。22q11.21-22q11.23区域的片段缺失与22q11.2缺失综合征〔22q11.2deletionsyndrome〕有关，临床表现为身材矮小，面部异常，智力障碍等。二、染色体核型分析〔三〕多种方法穿插使用——核型正常，B超异常的染色体因素深度排查〔一〕NIPT结果分析？结果检测项目阳性真阳性假阳性假阴性拒绝随访/失联21三体0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%性染色体异常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNVNIPT的假阳性胎儿染色体核型分型重视知情同意重视影像学的检查？结果检测项目阳性真阳性假阳性假阴性拒绝随访或失联21三体0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%（个别拒绝随访）性染色体异常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNV胎盘嵌合-假阳性发生率约1/1000NewEnglandJournalofMedicine，371;6577-578〔〕胎盘嵌合-假阴性17周NIPT检测结果：45，XO；羊穿结果：47，XX，+18MolecularCytogenetics.,7:4821假阴性原因排查过程原因排查过程 取样：母亲血细胞DNA、胎儿组织、胎盘组织 分析方法：测序、FISH和CMA母亲核型正常46，XX〔排除母体干扰〕NIPT流产的胎儿组织：T18胎盘组织：45,X(~60%)andT18(嵌合率~30%)FISH流产的胎儿组织：T18胎盘组织：45,Xcells(67%,62/92)andT18cells(30%,28/92)SNP-array流产的胎儿组织：T18胎盘组织：45,Xcells(67%)andT18cells(50%)胎儿为100%浓度的47，XX，+18胎盘嵌合，大部分细胞为45,XO;少量细胞为47，XX，+18母体自身染色体异常干扰样本ID实验编号chr13chr18chr21180100721-0.4263.713-1.256180100722-0.5763.2290.366180100723-1.1094.207-0.676180100724-1.0152.816-0.631孕妇年龄30岁，孕27周，NIPT屡次上机均提示T18高风险。胎儿B超未发现任何异常，羊穿显示为46，XY。后来CNV分析显示为母体18号染色体短臂微重复所致的假阳性。影响无创产前筛查的因素母体染色体核型异常：母体的本质肿瘤：发生内在基因组成改变的状况胎盘嵌合体〔confinedplacentalmosaicism，CPM〕染色体单亲二倍体〔uni-parentaldisomy,UPD〕胎儿嵌合孪生儿消失现象胎儿游离DNA浓度太低：实验室操作错误

孕周〔>12W〕妊娠情况〔单胎/双胎/多胎〕既往病史如异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗、肿瘤、病毒感染等可能引入外源DNA或改变胎儿游离DNA的组成和比例，影响检测结果〕样本状态及运输 溶血？是否及时采用冷链运输知情同意非常重要！！分析前质量控制分析中质量控制产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区合理的实验室分区严格的实验室环境控制〔如温湿度，稳压或不连续电源〕仪器设备及管理〔PCR仪、离心机、加样器等定期维护并校准〕人员资质及培训产前筛查与产前诊断〔全基因组低拷贝测序技术〕缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区胎儿游离DNA浓度测定方法 多重SNP法(>4%) Y染色体法文库构建--DNA片段挑选尽可能消除母体基因组DNA的背景干扰，富集游离DNA〔cfDNA〕分析中质控准确的文库质检是后续获得高质量、均一数据的关键分析中质量控制荧光定量标准曲线法文库浓度测定：1.qPCR法/Qubit对DNA浓度准确定量；2.Aiglent2100对文库的质量进展定性2100检测结果分析后质量控制审核项数据要求异常处理原始数据量（M）≥3.5M重上机Q30(1000个碱基中的错误率)≤85重上机Uniquereads数量（M）≥2M重上机比对率≥62.5%重建库Duplication率≤15%重建库样本GC含量EDTA:38%-42%Ardent:35%-42%重建库分析完成后，首先查看原始数据量，Q30，对照品结果和GC偏移度是否通过等等..下机样本数据要求〔二〕CNV结果的解读发现明确致病的基因组拷贝数变异〔CNVs〕未检出染色体非整倍体或100kb以上明确致病的基因组拷贝数变异〔CNVs〕其他类型100Kb以上的拷贝数变异〔CNVs〕 数据库中没有记录的 数据库中记录为多态性的二、NIPT/CNVCNV结果分析样本类型临床意义没有检出致病性CNV意义不明CNV多态性总例数外周血43110761羊水0241126流产物34115353脐血10001总数7836161114二、NIPT/CNV特别关注！！！巨细胞病毒感染的现况胎儿先天性巨细胞病毒感染的后果巨细胞病毒的血清学检测巨细胞病毒的分子检测重视孕妇和新生儿的巨细胞病毒的检测四、巨细胞病毒的检测巨细胞病毒血清学检测 IgG和IgM滴度 IgG亲和力四、巨细胞病毒的检测IgG抗体检测阳性率：>90%IgM抗体检测阳性率〔4.5个月〕

四、巨细胞病毒的检测围产期感染宫内感染(先天性CMV感染)2.胎儿巨细胞病毒感染我国育龄妇女几乎均为巨细胞病毒抗体阳性；巨细胞病毒的先天性感染是儿童感觉神经性耳聋最主要的病因，早期诊断价值高；抗体阳性孕妇对巨细胞病毒的垂直传播并不低于孕期胎儿的原发性感染。四、巨细胞病毒的检测垂直传播：病毒血症孕妇的垂直传播率高达44%不良妊娠结局：死胎90%出生时没有病症，后遗症13%10%出生时有病症，60%的后遗症：听力、视力、智力，脑发育和肝脾、血液系统等〔7岁前发生〕羊水的病毒载量与垂直传播风险和后遗症的病症相关原发性感染复发性感染埋伏在体内的CMV被重新激活再次感染外源性其他血清型的病原体。假如妊娠前的免疫状态未知，诊断基于特异性IgM抗体，特异性IgM抗体阳性的孕妇只有部分为原发性感染复发性感染孕妇中也可检出IgM抗体，并且原发性感染数月后血清中还可检出IgM抗体IgM抗体阳性可能还包括IgM抗体假阳性者抗体：间隔3～4周后重复测定诊断根据包括血清转化现象(初次血清抗体阴性的孕妇出现特异性IgG抗体)，或者IgG抗体滴度增加4倍IgG抗体亲和力测定：亲和力指数<30％，提示孕妇CMV感染为近2-4个月内的原发性感染。IgM抗体阳性伴随低亲和力IgG抗体在诊断母体原发性CMV感染方面优于单纯血清抗体检测。病毒的别离培养或PCR检测感染的血液、尿液、唾液、宫颈分泌物或母乳乳汁诊断。3.识别妊娠期母体原发性CMV感染困难四、巨细胞病毒的检测4.重视巨细胞病毒的分子检测孕期巨细胞病毒的分子检测，明确孕妇的荷毒量；必要的时候进展羊水巨细胞