基因定位与克隆

基因定位与克隆第1页，共54页，2023年，2月20日，星期四本章节重点基因定位和基因克隆的概念连锁分析遗传标记基因克隆的策略第2页，共54页，2023年，2月20日，星期四基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。1911年，Wilson将红绿色盲基因定位到X染色体1968年，Duffy血型基因定位于1号染色体第3页，共54页，2023年，2月20日，星期四基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。第4页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁分析第5页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第6页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第7页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第8页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第9页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第10页，共54页，2023年，2月20日，星期四重组值(recombinationfraction)：是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。厘摩(centimorgan，cM)连锁分析第11页，共54页，2023年，2月20日，星期四遗传标记用连锁分析法进行基因定位时需要的一些已知遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以便显示连锁关系，这些标记位点称为遗传标记（geneticmarker）。第12页，共54页，2023年，2月20日，星期四血型，血清蛋白，HLADNARFLPDNASTR&DNAVNTRSNP遗传标记第13页，共54页，2023年，2月20日，星期四重组值＝0：10个减数分裂重组值＝0.3：85个减数分裂遗传标记第14页，共54页，2023年，2月20日，星期四连锁分析第15页，共54页，2023年，2月20日，星期四EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ3.0kb1.7kb探针Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ121234567812345678连锁分析第16页，共54页，2023年，2月20日，星期四Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ1212345678123456783.0kb1.7kb4.7kb连锁分析第17页，共54页，2023年，2月20日，星期四4.7kb3.0kbNeurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ121234567812345678连锁分析第18页，共54页，2023年，2月20日，星期四Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ1212345678123456784.7kb3.0kb连锁分析第19页，共54页，2023年，2月20日，星期四1955，Morton:优势对数法(Lod)+3表示连锁存在-2表示连锁不存在连锁分析第20页，共54页，2023年，2月20日，星期四多点连锁定位利用三点杂交法(threepointcrosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确的进行基因定位。连锁分析第21页，共54页，2023年，2月20日，星期四子代类型重组位置数目ABC/abc非重组体853abc/abcABc/abc(A，B)–×-C5abC/abcaBC/abcA–×–(B，C)47Abc/abcAbC/abcB–×–(A，C)95aBc/abc多点连锁定位第22页，共54页，2023年，2月20日，星期四体细胞杂交(somaticcellhybridization)又称细胞融合(cellfusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybridcell)。病毒诱导的细胞融合——仙台病毒化学融合技术——聚乙二醇(PEG)电融合技术——电穿孔法体细胞杂交第23页，共54页，2023年，2月20日，星期四体细胞杂交第24页，共54页，2023年，2月20日，星期四异核细胞体细胞杂交第25页，共54页，2023年，2月20日，星期四体细胞杂交合核细胞杂种细胞第26页，共54页，2023年，2月20日，星期四两个同种的动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双亲的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双亲的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。体细胞杂交第27页，共54页，2023年，2月20日，星期四HAT选择系统1962，人类HPRT-1964，小鼠TK-H：次黄嘌呤(hypoxanthine)A：氨基喋呤(Aminopterin)T：胸腺嘧啶(Thymidine)第28页，共54页，2023年，2月20日，星期四HPRT－TK－HAT选择系统第29页，共54页，2023年，2月20日，星期四TK－HPRT－HAT选择系统第30页，共54页，2023年，2月20日，星期四HAT选择系统第31页，共54页，2023年，2月20日，星期四体细胞杂交TK:chromosome17第32页，共54页，2023年，2月20日，星期四杂种细胞克隆嵌板HybridcloneHumanchromosome12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-第33页，共54页，2023年，2月20日，星期四微细胞融合(microcellfusion)体细胞杂交人工建立的仅含有一条人类染色体的杂种细胞，即微细胞，再与啮齿类细胞进行融合。第34页，共54页，2023年，2月20日，星期四区域定位(regionalassignment)体细胞杂交依据染色体结构畸变的特点，建立只含有特殊的部分人类染色体的杂种细胞，再与啮齿类细胞进行融合。第35页，共54页，2023年，2月20日，星期四辐射杂种(radiationhybrid)体细胞杂交用含有辐射切割的人类染色体片段的细胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。1975年，Goss和Harris提出1990年，Cox构建单染色体杂种细胞1994年，Walter建立全基因组放射杂种第36页，共54页，2023年，2月20日，星期四原位杂交(InSiteHybridization，ISH)：利用同位素标记的DNA探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。原位杂交技术第37页，共54页，2023年，2月20日，星期四原位杂交技术第38页，共54页，2023年，2月20日，星期四荧光原位杂交(FISH)：用特殊的荧光素标记DNA探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。原位杂交技术第39页，共54页，2023年，2月20日，星期四原位杂交技术第40页，共54页，2023年，2月20日，星期四网络定位第41页，共54页，2023年，2月20日，星期四基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。基因克隆第42页，共54页，2023年，2月20日，星期四功能克隆(functionalcloning)是先研究相关基因的功能，再定位克隆该基因。血红蛋白病HbS——血红蛋白缺陷(1949)

——β链Glu6ValGAG→GTG

——11p(70年代)功能克隆第43页，共54页，2023年，2月20日，星期四定位克隆定位克隆(positionalcloning)是将遗传病或发育异常畸形与相关表型之间，和由这些突变失活的基因所编码的特定蛋白质之间联系起来，而提供的一种基因定位克隆方法。第44页，共54页，2023年，2月20日，星期四定位克隆定位克隆的等级应用细胞遗传学或连锁分析方法将基因定位于染色体的特定区域从该区域内所有可能的候选基因中确定正确的基因第45页，共54页，2023年，2月20日，星期四定位克隆定位克隆的基本方法和步骤收集家系，选择遗传标记进行连锁分析，对目的基因作图定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位从候选基因中确定正确的基因第46页，共54页，2023年，2月20日，星期四年代疾病年代疾病1986慢性肉芽肿瘤Duchenne肌营养不良视网膜母细胞瘤1993Menkes病X连锁无丙种球蛋白血症肾上腺白质营养不良1989囊性纤维变性神经纤维瘤Ⅱ型1990

Wilms瘤神经纤维瘤Ⅰ型睾丸决定因子(TDF)无脉胳膜症Huntington病VonHippel-Lindou病脊髓小脑性共济失调Ⅰ型Wilson病1991脆性X综合征家族性结肠息肉症Kallmann综合征无虹膜症1994结节硬化症多囊肾病1型Wiscott-Aldrich综合征早发性乳腺癌/卵巢癌(BRCA1)1992肌强直性肌营养不良Lowe综合征先天性肾上腺发育不良用定位克隆法鉴定的致病基因第47页，共54页，2023年，2月20日，星期四用定位克隆法鉴定的致病基因年代疾病年代疾病1995点状软骨发育不全肢带肌营养不良眼白化病毛细血管扩张性共济失调Alzheimer病(14号染色体)Alzheimer病(1号染色体)低磷酸盐血性佝偻病遗传性多发性外生骨疣Bloom综合征1996Friedreich共济失调进行性肌阵挛癫痫长QT综合征(11号染色体)Werner综合征X连锁视网膜色素变性(RP3)多囊肾病2型基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常血色病Chediak-Higashi综合征青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12号染色体)第48页，共54页，2023年，2月20日，星期四ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop定位克隆第49页，共54页，2023年，2月20日，星期四候选克隆候选克隆(candidatecloning)是一种用定位和非定位的信息相结合来克隆致病基因，即根据一些基因的位置、表达、功能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。第50页，共54页，2023年，2月20日，星期四