DB2310T 007-2019黑木耳液体菌种生产技术规程

ICS65.020.20B05牡丹DB2310江市地方标准DB/T007—2019牡丹江市市场监督管理局发布IDB2310/T007—2019前言本标准依据GB/T1.1-2009的编写规则起草。本标准由黑龙江省食用菌标准化技术委员会牡丹江分委员会提出并归口。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院牡丹江分院。本标准主要起草人：王延锋、于海洋、张运岐、罗连富、贾利阳、杨峰山、丁仕波、史磊、张荣芳、高天一、董雪梅、王金贺、刘姿彤、谷维、潘春磊、盛春鸽、张鹏、宋佳鑫、赵鹤、赵静。1DB2310/T007—2019黑木耳液体菌种生产技术规程1范围菌种保藏及运输、记录与档案。本标准适用于黑木耳液体菌种的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB150压力容器GB3095环境空气质量标准GB5749生活饮用水卫生标准GB/T12728食用菌术语GB/T13554高效空气过滤器GB15618土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准GB22207容积式空气压缩机安全要求GB50073洁净厂房设计规范NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY/T2375食用菌生产技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1经不同方法选育出来的具有特异性、遗传型、稳定性，适用于液体发酵、固体栽培的食用菌菌种。3.2黑木耳液体菌种用液体培养基，在生物发酵罐中，通过深层培养(液体发酵)技术生产的液体形态的黑木耳菌种。3.3液体菌种发酵罐也称之为食用菌液体菌种培养器，是指进行食用菌液体菌种培养的专用设备。要求不锈钢材质，符2DB2310/T007—2019合GB150要求。3.4起始pH液体培养基配制后尚未灭菌的pH。3.5终止pH液体菌种达到放罐指标时的培养基pH。3.6发酵罐空消对尚未投料的空发酵罐进行高压蒸汽灭菌。3.7发酵罐实消对投料后的发酵罐及发酵罐内培养基进行高压蒸汽灭菌。3.8接种量接入发酵罐中的食用菌菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比表示。3.9通风量发酵罐培养液体菌种过程中每分钟通入培养基的无菌空气的量，以培养基体积/通入空气体积表示。3.10液体菌种菌龄指菌种接入培养基后，液体菌种的生长发育时间。3.11放罐液体菌种菌丝生长旺盛，达到生长对数期时结束培养，在无菌条件下从发酵罐通过传送管在0.15MPa压力下，注射接种到栽培袋中。3.12镜检指通过显微镜观察液体菌种的菌丝生长发育状态以及是否有杂菌污染。4生产条件4.1厂址选择3DB2310/T007—2019应建立在交通便利，地势干燥，通风良好，水源充足，远离禽畜舍、垃圾堆积场，无污水、废气、废渣和粉尘等污染源。水质应符合GB5749的规定；大气应符合GB3095的规定；土壤环境质量应符合GB8的规定。4.2厂房设置和布局液体发酵间和接种间按照GB50073洁净厂房设计规范执行，应按液体菌种生产工艺流程合理安排布局，无菌区与有菌区有效隔离。4.3基础设备菌种配制室、灭菌室、无菌净化操作室、恒温培养室、发酵罐培养室、化验室和菌种室，要有调温设施，排水系统，排气设备，进入无菌区缓冲间，规模要配套，布局合理。4.4生产仪器和设备T净化工作台、冰箱、磅秤、天平、液体菌种接种枪、恒温回旋式振荡器应符合相关的使用规定。4.5检验设备恒温培养箱、显微镜、天平、酸度计等、玻璃三角瓶、试管、培养皿、定量定性滤纸、精密pH试纸。5菌种选择应选用适于当地栽培、发菌出耳及转潮快、抗逆性强、优质、高产、商品性好，经省级以上农作物品种审定委员会审(认)定的品种。菌种生产应符合NY/T528的规定。6液体菌种生产技术要求6.1工艺流程生产。4DB2310/T007—2019程6.2母种制备6.2.1母种培养基的制作按照附录A.1配方配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)或附录A.2配方配制综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基(CPDA)，分装至试管长度五分之一处，使用棉塞或胶塞封住试管口，放入高压蒸汽灭菌锅中，温度121℃，灭菌30min，灭菌结束摆放斜面冷却凝固。6.2.2接种与培养无菌条件下，用接种钩取黄豆粒大小的原始菌种接种在母种培养基上恒温培养箱中培养，培养温度避光培养10d-15d。6.3摇瓶菌种制备6.3.1摇瓶培养基的制作BGBminminL用封口膜封口，灭菌压力为0.125Mpa，灭菌时间40min。灭菌时加盖牛皮纸防潮。6.3.2接种与培养无菌条件下，用接种铲将母种接入摇瓶液体培养基中，每瓶接15-20块，接种完成贴好标签置于25℃培养温度为25℃-28℃。培养期间定期检查，除去污染或异常菌种，并留样用于检测。6.4液体菌种制备6.4.1投料前准备检查发酵罐罐体有无变形，全部阀门、压力表、控制面板，有内置电加热棒的发酵罐，加热棒是否完好，有无漏电，是否能够正常工作。对罐体内、外用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物。5DB2310/T007—2019发酵罐每次使用前要对罐体进行空消，有内置加热棒的空消时加水必须没过加热棒，121℃-124℃灭菌60min；用外源蒸汽灭菌的发酵罐，蒸汽压力达到0.105Mpa-0.125Mpa，121℃-124℃灭菌40min。6.4.2液体培养基的制作6.4.3投料与定容将原材料用冷水溶解，倒入或用泵抽入发酵罐中，加水定容至罐体规定体积，如果用到马铃薯等固体原料需要提前用开水煮沸30min，宜用三层纱布过滤，再将滤液与其他培养料搅拌均匀。6.4.4起始pH6.4.5发酵罐实消发酵罐内蒸汽压力达到0.125Mpa，温度达到124℃时，内置罐需下排料1次，外置罐需要上下排料各1次，灭菌时间保持60min，温度上升过程需将排气阀微开防止罐体内形成假压，保压过程保持排气阀微开。6.4.6冷却灭菌结束后将冷水通入发酵罐夹层或内置冷却系统中循环降温，降温过程中向发酵罐内通入无菌空气同时打开排气阀，培养基温度降温至24℃-28℃停止通入冷凝水，罐内压力维持在0.05Mpa。6.4.7接种按下列步骤完成：a)用无菌水喷洒发酵罐上方进行降尘处理；b)在接种口放置内径略大于接种口并蘸有95%酒精的纱布火焰圈，点燃火焰圈；c)调节压力表，使发酵罐内压降至0.01Mpa，打开入料口同时关闭排气阀，火焰旁打开已经表面消毒的摇瓶菌种封口膜，灼烧瓶口后迅速将菌种倒入发酵罐中；d)用火焰外焰灼烧接种口盖，迅速拧紧，移走火焰圈同时打开排气阀，调整压力表保持发酵罐压力6.4.8液体菌种培养培养阶段应满足下列条件：b)罐压保持在0.03Mpa-0.05Mpa；6.4.9液体菌种检测取样：接种1d后进行隔天检测，用酒精灯外焰灼烧取样阀，弃掉最初流出液体，取一定量的液体流入无菌三角瓶中，备用。6DB2310/T007—2019检测：将样品在PDA平板培养基上培养，观察是否有杂菌污染，无杂菌污染观察菌落生长情况，达到6.5留样菌种和培养基均应留样备查：b)摇瓶菌种使用时取样30mL-40mL，用三角瓶留存；c)发酵罐实消后的空白培养基取样30mL-40mL，用三角瓶留存；e)发酵终止后取样80mL-100mL，用三角瓶留存。7菌种保藏及运输液体菌种生产好后，应立即进入菌种生产或栽培袋接种使用，若因某些原因不能立即使用时需降温保压处理。一般在4℃－10℃下存放不超过2d。液体菌种不宜长途运输。8记录与档案应建立生产档案，内容包括产地环境、品种选择和质量要求，母种、摇瓶液体种和发酵罐液体菌种生产的每个环节等。生产记录由具体操作人员现场记录填写，定期由主管领导审核，签字后归档，档案保存7DB2310/T007—2019(规范性附录)常用母种培养基及配方A培养基(PDA)配方：马铃薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，水定容至A.2综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基(CPDA)配方：马铃薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，磷8DB2310/T007—2019B(规范性附录)黑木耳液体菌种培养基参考配方AmL。9DB2310/T007—2019(规范性附录)黑木耳液体菌种培养放罐指标项目指标发酵液色泽球状菌丝体因品种而异，一般呈白色，滤液呈淡黄色或黄褐色，清澈透明。菌液形态菌液稍粘稠，菌丝体稠密且均匀分布，菌液不混浊。菌液气味无酸、臭味、霉味、发酵酒精味等异味。pH5.5-6.0。显微镜下菌丝形态黑木耳菌种液体培养中特有的球状和从状菌丝形态，菌丝粗壮，分布均匀样品无菌检查无霉菌、细菌、酵母菌等杂菌菌落生长DB2310/T007—2019D(资料性附录)黑木耳液体菌种培养检验项目项目指标检验方法菌液颜色和透明度呈淡黄色或黄褐色，清澈透明。感官鉴定菌液形态菌液稍粘稠，菌丝体稠密且均匀分布，菌液不混浊。感官鉴定菌液气味无酸、臭味、发酵酒精味等气味。感官鉴定菌丝形态可见黑木耳菌种液体培养中特有的菌丝形态，大量分枝菌丝分布，菌丝纤细，有锁状联合，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深。显微镜(低倍镜、高倍镜、