基因工程7课件

基因工程

GENEENGINEERINGE-mail:1Chapter7克隆基因的表达2Chapter7克隆基因的表达第一节基因表达的基本过程第二节外源基因在原核细胞中的表达第三节外源基因在真核细胞中的表达3第一节基因表达的基本过程5一、基因表达的基本规律（一）时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性（temporalspecificity).多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性（stagespecificity).6一、基因表达的基本规律(二）空间特异性在个体生长全过程中，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性（spatialspecificity).基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官上的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性（cellortissuespecificity).7二、基因表达的方式按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：（一）组成性表达某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因（housekeepinggene)9二、基因表达的方式无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其它基因，这类基因表达被视为组成性基因表达（constitutivegeneexpression).如微管蛋白基因、糖酵解系基因与核糖体蛋白基因等。10二、基因表达的方式（二）诱导和阻遏表达在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导（induction)如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏（repression)11四、基因表达调控的基本原理（一）基因表达的多级调控DNA水平：基因丢失；基因扩增；基因重排；甲基化修饰；染色质的结构状态RNA水平：转录水平调控；RNA的转录后加工；mRNA从核内向胞浆转运；mRNA稳定性蛋白质水平：翻译过程；翻译后加工；蛋白质的稳定性13四、基因表达调控的基本原理（二）基因转录激活调节基本要素1、特异的DNA序列：如启动序列，操纵序列，Pribnow盒，GC序列等。2、调节蛋白：如阻遏蛋白，激活蛋白，CAP，转录因子等。3、DNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质相互作用4、RNA聚合酶14五、基因表达的基本过程外源基因在宿主细胞中的表达15第二节外源基因在原核细胞中的表达用原核生物作宿主17第二节外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势：1、全基因组测序，共有4405个开放阅读框架2、基因克隆表达系统成熟完善3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定4、被USAFDA批准为安全的基因工程受体生物18第二节外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌表达外源基因的劣势：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。19乳糖操纵子的结构21一、原核生物基因表达的特征3、转录和翻译偶联、连续进行22一、原核生物基因表达的特征4、不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5、调控主要在转录水平上。6、mRNA的核糖体结合位点：Shine-Dalgarno(SD)sequence在起始密码子上游约4～7个核苷酸之前还有一段富含嘌呤的5′…AGGAGG…3′短小序列，它可以与16SrRNA3′端的3′…UCCUCC…5′区段完全互补。mRNA上的这段序列称为ShineDalgarno序列（简称SD序列）。23三、原核生物基因表达的调控大肠杆菌基因表达载体的基本结构特征25三、原核生物基因表达的调控1、启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。（1）启动子序列大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence):-35boxand-10box.26原核启动子共有序列的功能29三、原核生物基因表达的调控（2）翻译的起始位点①核糖体结合位点(ribosomebindingsite,RBS)1)SDsequence:mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。30三、原核生物基因表达的调控2）起始密码位于SD序列下游AUG(91%)GUG(8%)UUG(1%)31三、原核生物基因表达的调控3）RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA,rRNAandmRNA.结构:全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基和两个大亚基（β和β’），一个δ亚基。

32三、原核生物基因表达的调控4）转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。33终止形成的原因①茎环结构反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作。②多聚A/U由于茎环3’端紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。34终止原因示意图35三、原核生物基因表达的调控5)翻译终止密码大肠杆菌偏爱UAA.一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping)。6)翻译增强子（translationenhancer)能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）；大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。36三、原核生物基因表达的调控7)基因工程常用的原核启动子最佳启动子必须具备的条件①必须是一种强启动子：能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录：便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的：用温度或化学试剂诱导。37四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1、细胞质中表达（1）包涵体（Inclusionbody)是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知！优点：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞缺点：回收的蛋白生物活性差如：humanGrowthHormone,hGH38四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位2、周质中表达（1）周质（periplasm)格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚。优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。39四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位3、胞外表达使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。40大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白的优缺点41五、几种类型的原核表达载体1、非整合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。42举例：Pkk223-3载体哈佛大学的GILBERT实验室建立的。表达能力强。组成结构如下：①强启动子：tac(trp-lac):trp的-35区-lacUV5的-10区②操纵基因：乳糖操纵子系统，lac操纵基因。43举例：Pkk223-3载体③调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统，如JM105菌，LacI.④终止子：rrnB的强终止子。⑤SD序列和插入位点区：SD-插入位点区44举例：Pkk223-3载体⑥载体的其余部分：来自pBR322质粒⑦表达诱导物：IPTG45举例：Pkk223-3载体46五、几种类型的原核表达载体2、分泌型表达载体载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连接在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如pINIII系列。47482、分泌型表达载体（1）组成结构①强启动子：Ipp(脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子②调节基因：lacI③SD序列和起始密码ATG④分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa⑤插入位点区（MCS）492、分泌型表达载体50五、几种类型的原核表达载体3、融合蛋白表达载体系统-pGEX系列表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。（1）优点：便于融合蛋白的分离和纯化。（2）组成结构：启动子，操纵基因，调节基因，SD序列，ori，融合肽（GST)51五、几种类型的原核表达载体(3)产物提纯GST融合蛋白用glutathionesepharose亲和层析柱分离纯化。（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以所外源蛋白从GST上切下来。52五、几种类型的原核表达载体(5)其它融合蛋白系统在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His)。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA洗脱下来，可以纯化蛋白质。5354六、影响外源基因表达效率的因素1、启动子的结构对表达效率的影响(1)一致顺序：-35box（5TTGACA3)and-10box(5TATAAT3)(2)-35boxand-10box之间的距离：间隔为17bp时，启动子最强。(3)-35boxand-10box区的碱基顺序：越接近一致顺序，启动子越强。5556六、影响外源基因表达效率的因素2、转译起始序列对表达效率的影响(1)SD序列SD序列与16srRNA分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的转译速率。当序列为5GGAGG3,可与16srRNA3’端完全互补，转译效率最高，而当该序列发生单碱基突变时，转译效率会下降30倍。SD序列后面的4个碱基，如果是A(T)，翻译效率最高；如果是G(C),效率只有50%或25%。57六、影响外源基因表达效率的因素(2)起始密码AUGAUG左侧的三个碱基也有影响。β-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC\UCA或AGG时下降20倍。AUG右侧的三个碱基也有影响。58六、影响外源基因表达效率的因素(3)其它多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U59六、影响外源基因表达效率的因素3、启动子与外源基因之间的距离60六、影响外源基因表达效率的因素4、转录终止区对表达效率的影响转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费原料和能量、不会干扰正常的表达。5、载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。6、外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响61七、提高表达水平常用的方法1、选择强启动子序列如tac等2、调整SD序列与AUG碱基的距离一般为5-9bp。距离过长或过短都影响真核基因的表达，根据不同的启动子选择不同的距离。3、改变起始密码下面的几组密码子能提高翻译的起始效率。62七、提高表达水平常用的方法4、增加mRNA的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入“重复性基因回文序列”能防止mRNA受到3‘-5’外切酶攻击。63七、提高表达水平常用的方法5、减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。(1)诱导表达：将宿主生长代谢与外源基因表达分开，一般采用温度诱导或药物诱导。如药物诱导弄（tac启动子），有无IPTG.(2)表达载体诱导复制：将宿主的生长与载体的复制分开。当需要宿主大量生长时，抑制载体的复制；当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增加拷贝数。64七、提高表达水平常用的方法6、提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。(1)设计成融合蛋白这是避免被降解的最好措施。N末端：由原核基因编码一段多肽C末端：是完整的真核外源基因。65七、提高表达水平常用的方法(2)使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。(3)表达分泌蛋白细菌蛋白分泌的条件①有信号肽：位于N端，一般为15-30aa。真核与原核的结构相似，功能相似，可以互换。66七、提高表达水平常用的方法②蛋白质内有与分泌相关的AA序列，为蛋白质指明目的地。③细胞内的转运机制信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。67八、细菌表达载体举例68九、外源蛋白质表达后的正确修饰1、形成正确的二硫键分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。69人胰岛素分子70九、外源蛋白质表达后的正确修饰2、前体切割如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割71九、外源蛋白质表达后的正确修饰3、蛋白质糖基化增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质(1)0-糖基化（Ser,Thr)(2)N-糖基化（Asn)72十、原核细胞表达的缺陷1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变形、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且表达量非常低。3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。73十、原核细胞表达的缺陷4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。74第3节外源基因在真核细胞中表达75一、真核生物表达概述1、真核生物表达的优越性和必要性2、真核生物的基因结构3、真核生物的表达调控特点4、真核生物的表达调控模式761、真核生物表达的优越性和必要性1）真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA.2）具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。3）某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。另外，由于真核生物表达调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控的机制。772、真核生物的基因结构1）真核生物中DNA极其非富：大肠杆菌基因组为4x106bp,哺乳动物基因组为109bp.如此丰富的基因组中克隆、筛选出某一目的基因就比较困难。782、真核生物的基因结构2）真核生物基因的不连续性：3）真核生物mRNA5’端有帽子结构，3‘端有polyA尾巴。792、真核生物的基因结构4）真核生物基因组中含有大量的重复序列高度重复序列，中度重复序列，单拷贝序列功能：编码一些功能十分重要、需要量极大的产物，如组蛋白，tRNA、rRNA等。重复序列中含有特殊结构，参与基因表达调控。如AT含量丰富，易解链，有利于与调控基因复制的蛋白相结合。与染色体构象、着丝点形成有关。803、真核生物的基因表达调控特点1）真核生物基因表达调控是多方面、多层次的A:真核生物DNA多与组蛋白形成复杂的高级结构，被包裹在核膜内，而核外（如线粒体DNA）等，这就增加了基因表达的层次性和复杂性。B:813、真核生物的基因表达调控特点2）一条成熟mRNA只能翻译出一条单一肽链，而不能形成原核生物的多顺反子。3）真核生物中转录和翻译在时间和空间上都是完全分开的，其功能相关基因分开，分别进行转录和翻译，而没有操纵子式的结构。824、真核生物的基因表达调控模式834、真核生物的基因表达调控模式1）转录前（基因组）的调控即基因结构上的改变，较稳定长久，包括基因丢失、基因重组、基因扩增、甲基化修饰等。2）转录水平的调控RNA聚合酶：真核生物共有三种RNA聚合酶，分别合成不同类型的RNA，其中RNA聚合酶II转录合成mRNA.844、真核生物的基因表达调控模式2）转录水平的调控A、顺式调控因子（cis-actingfactor)定义：与结构基因串联的特定DNA序列，对基因转录的精确起始和转录活性表重要作用。854、真核生物的基因表达调控模式2）转录水平的调控正调控元件i)启动子：真核生物启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始位点以及一个以上的功能组件。864、真核生物的基因表达调控模式ii)启动子的结构特点大小：真核200bp（原核60bp）核心启动子：30区，TATA盒，7-10bp—控制转录起始的准确性及频率。由TATA盒及转录起始位点即可构成最简单的启动子。CAAT盒、GC盒(这两种序列不是必备，可缺1或缺2或顺序互换），提高转录效率。所以，启动子包括至少一个转录起始位点及一个以上的功能组件。874、真核生物的基因表达调控模式