福建农林大学分子生物学-2课件

Cloningvectors

CloningvectorsplasmidsbacteriophagesCosmidBAC,YACanimalandplantvirusesbaculovirus,retroviruses质粒2-200kb发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。BecapableofvectorsReplicatedandisolatedindependentlyofthehost’sgenomeexprsssionvectors:strongpromotersselectablemarker.Asimportanttools：

easytoisolateeasytomanipulateandtransformate

invitrodevelopmentforDNAclonemethodtoexpressforeigngenesinprokaryotesandeukaryotes质粒的表型效应

致育性

1946年，Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖，F质粒或性质粒（sexplasmid)接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程"。绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒对药物和重金属离子抗性R因子R1质粒(94kb)使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性

对金属离子抗性

碲(Te+6)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等利用异常营养物Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等将许多化学毒物降解。降解酶由降解性质粒编码特殊有机物：樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷环保对植物的致病性Ti、Ri其他共生质粒：豆科植物共生固氮的根瘤菌结瘤(nod)和固氮(fix)基因EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒编码乳糖的利用等特性也与质粒有关

隐秘质粒(crypticplasmid):不显示任何表型效应的质粒遗传学特性a.消除(curing)b.遗传转移c.分子杂交

理化因子消除

丫淀橙、EB、利福平、丝裂霉素C、亚硝基胍、高温、紫外线消除作用不是药物对质粒DNA的破坏，而是对DNA复制的抑制质粒消除常自发地发生生物学方法：原生质体形成和再生理化因子对高度稳定的质粒消除不易奏效用溶菌酶处理等形成原生质体，再生后菌株便以很高的频率(94%)消除了质粒，如葡萄球菌、枯草杆菌、链霉菌、沙门氏菌等。消除机制尚不清楚，有人认为去壁形成原生质体时导致了质粒消除,另有认为质粒在原生质体再生过程中丢失的。质粒的拷贝数质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系：质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量×MWc/MWp

质粒的不相容性（incompatibility）在没有选择压力的条件下，两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。plasmidvectors1、是一独立的复制子；2、有筛选标记；3、具有酶切位点或多克隆位点；4、分子量小，拷贝数高。

质粒载体的设计双抗生素蓝白斑筛选多克隆位点表达载体质粒载体多种用途转录、测序、亚克隆、表达转化E.coli容易，可重复性高容易大量分离提纯质粒载体筛选方法插入失活α－互补：IPTG,X-GAL直接筛选：抗生素表达筛选（抗体筛选）Probe筛选质粒载体缺点ＣaCl2转化效率低克隆片段小于１０kb大量筛选时需要细胞裂解Cosmidvector带有cos位点的质粒载体4-6kb，带有选择标记，在构建cDNA文库中很有用。可携带大的外源DNA片段，克隆45kb真核基因。Phasmid载体含有噬菌体att位点（插入位点）的质粒。含有质粒的ori和噬菌体的ori。转移过程：农杆菌感染后，植物细胞接受刺激释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒，并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。改建理由：野生型Ti质粒分子量过大、缺乏合适的克隆位点、导致植株产生冠瘿病掌握原则:保留T-DNA的转移功能、取消T-DNA的致瘤性、通过简便手段可使外源DNA插入T-DNA之中。CaMV克隆载体含1个约8kb的环状双链DNA分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35SRNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。Cloningvectorsofanimalcell动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共价闭合环状分子感染率高，几乎100％寄主细胞能被感染能提供完整的真核基因转录所需的成分侵染性具有寄主特异性改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原用家蚕的核多角体