核酸优秀课件

第二章核酸

Nucleicacid

(4个学时）第一节概述一、核酸1869年，瑞士的一位年青科学家F.Miescher（1844-1895）从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离出一种有机物，称为核素，由于它有很强的酸性，就改称为核酸。1928年，英国GriffithS型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑，致病R型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙，不致病肺炎球菌实验

结果说明：加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌这种生物分子或遗传物质是什么呢？1944年，美国细菌学家Avery（1877－1955）及其同事的研究结果发现：转化因子就是DNA，DNA是生命的遗传物质肺炎球菌实验结论

纽约洛克非勒研究所Avery从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的R型肺炎球菌中结果发现，惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌1944年结论：DNA是生命的遗传物质1952年，Hershey和Chase病毒（噬菌体）放射性同位素35S标记病毒的蛋白质外壳，32P标记病毒的DNA内核，感染细菌。新复制的病毒，检测到了32P标记的DNA，没有检测到35S标记的蛋白质，DNA在病毒和生物体复制或繁殖中的关键作用。8年的时间更有说服力的噬菌体实验

1952年，Chargaff，Markham等应用纸层析及分光光度计大量测定各种生物的DNA碱基组成后，发现不同生物的DNA碱基组成不同，但总有A=T，G=C。

Chargaff

定则DNA双螺旋

1953年，DNA双螺旋结构模型的提出，被认为是二十世纪在自然科学中的重大突破之一。

WatsonCrickWilkins1958年Crick，提出“中心法则”1970年，Smith和Ｗilcox发现限制性内切酶1973年，Cohen获得第一个体外重组体1975年，Sanger发明酶法DNA快速测序1985年，Millus发明PCR技术二、核酸的种类脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid1、脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid遗传信息的载体真核生物在细胞核中高度卷曲双螺旋，与组蛋白组成染色体线粒体、叶绿体ＤＮＡ不与组蛋白结合原核生物位于核区，环状分子2、核糖核酸（RNA）

RibonucleicAcid

RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。

根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种rRNA（ribosomalRNA)

核糖体RNARNA总量的80%是核糖体的骨架，蛋白质的合成产所

tRNA：（transferRNA)转移、转运、受体RNARNA总量的15%氨基酸的受体（识别）

携带活化的氨基酸（转运）

种类很多,转移丙氨酸的tRNA叫做丙氨酸tRNA（或tRNAAla）

三RNA在蛋白质合成中的作用3.mRNA信使RNA1.rRNA核糖体RNA2.tRNA转运RNA

RNA作用第二节核酸的化学组成核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。核苷酸本身由核苷和磷酸组成,而核苷则由戊糖和碱基形成DNA与RNA结构相似，但在组成成份上略有不同。核酸戊糖（DNA－脱氧核糖，RNA－核糖

碱基

磷酸基核苷酸1、戊糖β—D—核糖(inRNA)β—D—

2’－脱氧核糖(inDNA)3、核苷与核苷酸磷酸碱基戊糖H2OH2O碱基磷酸戊糖糖苷键（N——C）脂键核苷核苷酸核苷酸碱基连接（糖苷键）脂键（对DNA为H）1`2`3`4`5`第三节核酸的结构一、核酸的一级结构二、ＤＮＡ高级结构三、ＲＮＡ结构一、核酸的一级结构定义：指核酸上的核苷酸排列顺序。(核苷酸相当于氨基酸、单糖的角色）连接键：3’，5’-磷酸二酯键骨架：多核苷酸的主链是戊糖和磷酸构成的走向：5’3’脱H2O脂键相连3`，5`-磷酸二酯键首尾3`5`TTT核苷酸的一级结构核酸一级结构的简写形式线条式缩写戊糖3`-OH5`-磷酸PA核苷酸5`3`首端末端PPPPPP

TCTAGC

OH

pApCpGpTpAOHpA-C-G-T-AOH

pA·C·G·T·AOH

pACGTAOH二、DNA分子的结构1、DNA的碱基组成

Chargaff定则：A=T，G≡C，即A+G=T+C

碱基组成有种的特异性

不具有组织特异性年龄、环境、营养状态的改变不影响碱基组成2、DNA的二级结构——Watson和Crick的双螺旋结构模型

实验依据：

电位滴定行为

碱基组成规律χ光衍射数据双螺旋模型特征结构大部分DNA所具有的双螺旋结构，亦称为B型小沟大沟1.反向、平行、右手螺旋5`3`5`3`2.链间碱基配对相连3.每10个碱基对螺旋上升一周4.螺距为3.4nm,相邻碱基对平面距离0.34nm5.一条链为主动链，另一条为被动链；碱基成对规律→当一条链的碱基顺序确定，则另一条必有相对应的碱基顺序，但两条链的碱基组成和排列顺序并不相同。5，—ATTGCTA—3，3，—TAACGAT—5，

在真核及原核细胞皆有证据显示短的Z型DNA存在。其他类型的DNA双螺旋Z型DNA左旋、细长

双螺旋结构的稳定因素提问：起稳定作用的有哪些力呢？疏水作用力（主要）

（又称碱基堆积力）氢键离子键碱基堆积力将所有碱基堆积起来，使水分子排除在这样的表面之外，从能量角度看最稳定不溶于水的非极性分子在水中相互联合，成串结合的趋势力成为碱基间的部分堆积力碱基间的氢键提问：为什么在双螺旋中是A—T，G—C形成氢键？DNA双螺旋模型的提出有什么意义？DNA双螺旋结构生物学意义第一次阐述了遗传信息的储存方式及DNA复制的机理，以准确的语言回答了DNA是如何成为遗传物质的。大大推动了分子生物学和分子遗传学的发展，被誉为20世纪最伟大的发现之一。最主要的成就是碱基互补（配对）。根据碱基互补，Watson和Crick提出DNA的半保留复制机制。半保留复制保证了亲代与子代性状的相似性，解释了遗传性状的稳定性。DNA双螺旋分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象原核生物DNA、真核生物细胞器DNA的三级结构是超螺旋真核生物染色体DNA的三级结构是核小体3、DNA的三级结构固定负超螺旋反之，则为正超螺旋自然界通常为负超螺旋。提问：DNA形成三级结构及染色体的意义何在？答案：压缩分子空间人体每个体细胞DNA长2m,细胞直径0.1mm,细胞核0.05mm环状DNA右旋原核生物以及真核生物

细胞器环状DNA的超螺旋

三级结构叶绿体中含有环状DNA线粒体中含有环状DNA细菌等原核生物质粒染色体真核细胞染色体的DNA念珠状三级结构

染色体的基本单位是核小体；核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成组蛋白八聚体，DNA双螺旋分子缠绕其上1.75圈（146bp）核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间由DNA和组蛋白H1连接三、RNA分子的结构一级结构中的戊糖是核糖，碱基中有尿嘧啶，而没有胸腺嘧啶。大多数RNA分子是一条单链。局部的碱基互补配对（A—U、C—G），

构成双螺旋双螺旋部分稳定因素也是碱基堆积力

1、tRNA的结构

tRNA的二级结构——三叶草型（四臂四环）

四环：二氢尿嘧啶环（D环）、反密码环、ΤψC环、可变环

四臂：二氢尿嘧啶臂（D臂）、反密码臂、

ΤψC臂、氨基酸臂

tRNA的三叶草型二级结构123叶子反密码子环

反密码子载运氨基酸臂4包含有3’-末端和5’-末端3’-末端是CCA携带氨基酸与氨基酸接受区相对环：7个核苷酸残基臂：5bp环正中的3个核苷酸残基

称为反密码子。氨基酸接受区反密码区环：8-12个核苷酸臂：3-4bp二氢尿嘧啶区TC区可变区tRNA在此环中含有TC环：7个核苷酸臂：5bp变化较大，3-18个核苷酸

tRNA的三级结构——倒L型

在二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对目前已知的tRNA的三级结构均为倒L形。2、mRNA的结构

一级结构：

mRNA分子大小相差很悬殊，从7s到60s不等。真核细胞mRNA：

单顺反子结构（为一条肽链编码）5´端有帽子结构

3´末端是polyA(多聚腺苷酸)尾巴

原核细胞mRNA：多顺反子结构（为多条肽链编码）5´端无帽子结构，3´末端不含polyA(多聚腺苷酸)尾巴

7-甲基鸟苷帽帽子结构能促进核蛋白体与mRNA的结合,加速翻译起始速度,同时可以增强mRNA的稳定性。3’末端多聚A的尾巴。可能与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定有关。与mRNA的半寿期有关，新合成的mRNA,polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短不均一核RNA（heterogeneounuclearRNA，hnRNA）：在细胞核内合成的mRNA的初级产物，经过剪接成为成熟的mRNA并移到细胞质。3、rRNA占RNA总量的80％原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s动物细胞核糖体rRNA有四类：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。许多rRNA的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。许多rRNA形成发夹形结构第四节核酸的性质

一、一般性质：1、两性电解质：通常偏酸2、性状3、溶解度4、分子性状5、粘度：DNA溶液展度极大，RNA溶液展度要小的得多。

6、碱解：RNA稀碱条件下降解，而DNA则不被降解7、含磷量——恒定：RNA为9.4%、DNA为9.9%8、颜色反应1)D核糖+浓HCl+苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色，测定RNA。2)D—2—脱氧核糖+酸+二苯胺共热产生蓝紫色，测定DNA。二、核酸的紫外吸收

在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。天然核酸紫外吸收值小于各成分核苷酸光吸收之和，是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的。判断核酸样品的样品的纯度纯的DNA样品：OD260/OD280=1.8纯的RNA样品：OD260/OD280=2.0样品中含有杂蛋白及苯酚,OD260/OD280比值即明显降低。三、核酸的变性、复性及杂交

1、变性（denaturation）：高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素）能破坏核酸中的氢键，使有规律的螺旋型结构变成单链的、无规律的“线团”，此作用称为核酸的变性。

蛋白质：高级结构————>松散肽链变性————>（变性不涉及肽键，）核酸：螺旋结构————>无规则线团变性————>（变性不涉及磷酸二脂键的断裂）2、变性重要特征——判断变性的标志

紫外吸收值急剧增加——增色效应或高色效应

粘度下降，比旋下降生物活性丧失

能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。3、DNA的热变性

DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为“熔点”或“解链温度”，用Tm表示，在此温度可得到紫外吸收最大变化值的一半。（双螺旋结构失去一半时）。Tm值是DNA的一个特征常数

影响Tm值的因素:DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44

介质的离子强度

溶液的pH值变性剂4、复性DNA热变性在一定条件下是可逆的，DNA水溶液加热变性时，双螺旋的两条链分开，如果将溶液缓慢冷却，则两条链可能发生特异的重组而恢复成双螺旋，这种现象称“退火”（annealing），这种双螺旋的重组过程称复性。

高温变性缓慢冷却热复性急速冷却复性失败核酸的复性紫外吸收值A260降低（减色效应）复性的特征比旋上升，粘度上升生物活性部分恢复温度要逐步降低变性DNA浓度高影响复性因素DNA片断大则复性就慢具有很多重复序列的DNA

复性也快

5、核酸的分子杂交(hybridization)定义：不同核酸单链通过碱基配对形成杂交分子的过程

分子杂交不仅可以在不同来源的DNA片段中形成，甚至可以在DNA和RNA之间也可以形成DNA—RNA杂交分子。探针（probe）

具有特异顺序的单链DNA或RNA分子，用放射性同位素或免疫方法进行标记后,可以用杂交方法测定样品中与其互补的顺序。杂交方式

a）直接用probe与菌落组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸位置——原位杂交技术。b）将核酸直接粘在膜上，再与探针杂交——狭缝印迹杂交。硝酸纤维素膜作支持物进行的杂交。Southern印迹（Southernbiotting）

DNA经酶解和电泳分离后，将其片段→硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，用同位素标记的DNA（或RNN）探针与之杂交，通过放射自显影，以探测目的片段的存在及片段长度。其它杂交技术1）

将RNA变性后转移到纤维素膜上再进行杂交——Northern印迹法。Northernblotting2）

抗原抗体结合分析蛋白质——Western印迹法（biotting）分子杂交的运用：测定基因拷贝数、基因定位、基因图谱的构建。第五节核酸研究技术一、核酸的提取1、DNA的提取1）盐溶液溶解DNA－核蛋白，苯酚氯仿去除蛋白质2）SDS裂解细胞，蛋白酶除蛋白，RNase除RNA3）氯化铯密度梯度离心要求：低温、防止污染、防止机械损伤、杂质除尽2、RNA提取玻璃器皿高温烧烤，塑料器皿高温灭菌，其余的用DEPC（0.1％焦碳酸二乙酯）处理提取过程加入强RNA变性剂－－－－RNase无处不在RNA常用提取方法异硫氢酸胍/苯酚－氯仿（小量制备）胍盐/氯化铯密度梯度离心（大量制备）二、琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持介质的电泳染色：EB制备容易，分离范围广，尤其适于分子量较大的样品，但分离率比PAGE低影响迁移速率的因素核酸分子量大小（反比）凝胶浓度（反比）DNA构象：超螺旋>开环>线型电压（正比）三、聚合酶链式反应（PCR）技术原理：模拟DNA体内复制，通过热变性－退火－延伸的不断循环，使模板序列得到指数级扩增。步骤：变性、退火、延伸体系：引物、模板、DNA聚合酶、dNTP、Mg离子、矿物油、缓冲体系四、核酸序列测定测序目的：获得未知序列确定重组DNA方向与结构对突变进行定位和鉴定第六节DNA和基因组织

一、遗传的信息流（中心法则）

DNA是遗传信息的载体，通过自我复制把遗传信息从亲代传递到子代。在后代的个体发育中，遗传信息从DNA转录到RNA分子上，然后翻译成特定的蛋白质。通过蛋白质执行生物功能，表现出亲代相似的遗传特征。

在RNA病毒中，RNA是遗传信息的携带者，RNA可以复制，并同时做为mRNA起作用。指导病毒蛋白质的合成。RNA分子还可以通过反转录（或逆转录）将遗传信息传递给DNA分子，这就是所谓的中心法则。二、基因（gene)1、基因是遗传的最小功能单位，是DNA上的功能片段2、基因包含二类：结构基因：为多肽或RNA编码的基因调节基因：只有调节功能的片段。

基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体