T细胞进展TCRMHC2012课件

T细胞识别抗原的分子基础一、TCR及其共受体二、MHC分子及其与抗原肽的相互作用三、MHC多聚体及其应用T细胞对抗原的识别是

特异性免疫应答发生的先决条件T细胞识别抗原的物质基础是其表面的TCRTCR识别的配体是与MHC分子结合的抗原肽TCR识别需要CD4/CD8分子作为共受体AntigenrecognitionbyTcellsrequirespeptideantigensandpresentingcellsthatexpressMHCmolecules一、T细胞抗原受体（TCR）结构基因及多样性形成的机制与抗原肽/MHC复合物的相互作用ThestructureoftheTcellreceptorStructureofTCRissimilartothatofFab图1Domainstructure:IggenesuperfamilyMonovalentNoalternativeconstantregionsNeversecretedHeterodimeric,chainsaredisuphide-bondedVeryshortintracytoplasmictailPositivelychargedaminoacidsintheTMregionAntigencombiningsitemadeofjuxtaposedVaandVbregions30,000identicalspecificityTcRpercellTheTcellantigenreceptor• TcRarehighlyvariableinanindividual• DiversityfocusesonsmallchangesintheshapepresentedattheendoftheTcellreceptor(CDR).• ThemechanismsresponsibleforvariabilityarecloselyrelatedtothedevelopmentalstagesofTcells• Themechanismsofdiversitygenerationaresimilartothoseusedintheimmunoglobulingeneswithrespectto: Geneorganisation,rearrangementandrandomjoiningerrorTcellantigenreceptordiversityGenerationofdiversityintheTcRCOMBINATORIALDIVERSITYMultiplegermlinesegmentsInthehumanTcRVariable(V)segments:~70,52Diversity(D)segments:0,2Joining(J)segments:61,13TheneedtopairandchainstoformabindingsitedoublesthepotentialfordiversityJUNCTIONALDIVERSITYAdditionofnon-templateencoded(N)andpalindromic(P)nucleotidesatimprecisejointsmadebetweenV-D-JelementsSOMATICMUTATIONISNOTUSEDTOGENERATEDIVERSITYINTcRTcRagenerearrangementbySOMATICRECOMBINATIONSplicedTcRmRNAGermlineTcRVnJCV2V1RearrangedTcR1°transcriptRearrangementverysimilartotheIgLchainsRearrangedTcR1°transcriptSplicedTcRmRNAL&Vx52D1JC1D2JC2GermlineTcRTcRbgenerearrangementSOMATICRECOMBINATIOND-JJoiningV-DJjoiningC-VDJjoiningGenerationofdiversityintheTcRCOMBINATORIALDIVERSITYRandomrecombinationofmultiplegermlinesegmentsJUNCTIONALDIVERSITYReadingDregionin3framesAdditionofP&NnucleotidesNOSOMATICMUTATIONInTcRTcellreceptor-and-chaingenerearrangementandexpressionElementImmunoglobulin

TcRVariablesegmentsDiversitysegmentsDsegmentsinall3framesJoiningsegmentsJointswithN&PnucleotidesNo.ofVgenepairsJunctionaldiversityTotaldiversityH51~30Rare5235193640~1013~1013~1016**~1016690-5(1)*52~7020Often-136121*OnlyhalfofhumankchainshaveN&Pregions**NoofdistinctreceptorsincreasedfurtherbysomaticmutationEstimateofthenumberofhumanTcRandIgV(D)JrearrangementsduringTcelldevelopment

-chainfirst,then-chainTheoutlinestructuresoftheCD4andCD8co-receptormoleculesCoreceptorinteractionsCD4:monomer,4IgSFdomains,bindingMHCII.CD8:2chainswithsingleIgSFdomain,

CD8:conventionalMHCI

CD8:nonclassicalMHCITheCD8-MHCinteractionhasaKoffatleast2ordersofmagnitudefasterthanTCR-pMHCinteractions,andtheCD4-MHCinteractionseemstobemuchlessstable.CoreceptorsbindtothesameMHCmoleculeengagedbytheTCR,andassociatewiththeTCRviathesignalingmoleculesp56lckandZAP-70.ThebindingsitesforCD4andCD8onMHClieintheIg-likedomainsCoreceptorinteractionsandstructurehierarchicalaffinitydifferencesinTCR-pMHCandcoreceptor-MHCcomplexesensuretheseeventsoccursequentially.TheTcellreceptorbindstotheMHC:peptidecomplex（一）经典的HLA-I类和-II类抗原1．HLA-I类分子结构 *由链（重链）和链（轻链）组成的异源二聚体，其中重链由HLA-I类基因编码且为跨膜链，具有多态性。 *可分为4个区

(1)肽结合区：结合抗原肽，多态性区域

(2)Ig样区：与CD8分子结合的部位

(3)跨膜区：将HLA分子锚定在胞膜上

(4)胞浆区：与信息转导有关ThestructureofanMHCclassImolecules(determinedbyX-raycrystallography)MHC-I类分子结构α链：43KDaβ链：12KDa2.HLA-II类分子的结构 *由链和链组成的异源二聚体，链和链均由HLA-II类基因编码且均为跨膜链，均具有多态性。 *可分为4个区

(1)肽结合区：结合抗原肽，多态性区域

(2)Ig样区：与CD4分子结合的部位

(3)跨膜区：将HLA分子锚定在胞膜上

(4)胞浆区：与信息转导有关ThestructureofanMHCclassIImolecules(resembleMHCclassImoleculesinstructure)MHC-II类分子结构α链：34KDaβ链：29KDa（二）MHC生物学功能及其分子机制1、MHC分子的生物学功能抗原提呈MHC分子的抗原结合凹槽选择性结合抗原肽→形成MHC分子-抗原肽复合物→以MHC限制性的方式供T细胞识别→启动特异性免疫应答。*CD4+T细胞识别抗原肽/MHC-II复合物*CD8+T细胞识别抗原肽/MHC-I复合物MHC分子提呈抗原肽供T细胞识别TCR识别抗原肽的MHC限制性2、MHC分子与抗原肽的相互作用（1）抗原肽和MHC分子相互作用的分子基础MHC分子方面*MHC的多态性集中在结合区

MHC分子与抗原肽结合的部位是肽结合区中的肽结合槽，是多态性集中的区域，即型别不同的MHC分子的抗原肽结合槽部位的氨基酸组成和顺序存在差异。等位基因多态性集中于肽结合区抗原肽方面*抗原肽借助锚定残基与MHC分子的抗原肽结合槽结合锚定残基：抗原肽并不是整段地与抗原肽结合槽结合，而是以2个或数个氨基酸残基结合于MHC分子的抗原肽结合槽中，抗原肽上这些氨基酸残基为锚定残基。抗原肽以锚着残基与MHC抗原肽结合槽结合PeptidebindstoMHC-Imoleculethroughanchorresidues

PeptidesbindingtoMHC-IImoleculesarevariableinlengthandresidueslieatvariousdistancesfromtheendsofthepeptide

（2）抗原肽与MHC分子相互作用 *抗原肽借助锚定残基与MHC分子抗原结合槽结合 *不同MHC等位基因产物，其抗原结合槽结构存在差异，从而决定其选择性结合不同的抗原肽 *能够与同一型别MHC分子结合的抗原肽，其锚定位和锚定残基往往相同或相似3、MHC型别影响个体对抗原应答性质和强度

*不同MHC提呈同一抗原分子的不同抗原肽

应答针对的表位不同*同一抗原肽与不同MHC结合的亲合力不同

应答的强度不同MHCallelescontroltheimmuneresponsivenessMHC分子提呈抗原肽供T细胞识别（一）MHC-抗原肽四聚体

MHC-抗原肽四聚体是借助亲和素-生物素结合的原理，在体外将MHC分子（MHC-I类分子包括β2微球蛋白）及其所提呈的抗原肽组装成的MHC/抗原肽四聚复合物，作为TCR结合的配体，用于检测和分离特异性T细胞三、MHC-抗原肽四聚体技术（MHC-peptidetetramer）HLA-抗原肽四聚体结构示意图

通过生物素-亲和素的作用，将4个MHC-I/抗原肽单体连接成四聚体，亲和素分子上还结合有荧光标记物质（PE），用于检测或分离抗原特异性T细胞HLA-抗原肽四聚体用于检测或分离特异性T细胞（二）HLA-I/抗原肽四聚体的应用1、检测病毒抗原特异性CTL*CMV抗原肽/HLA-I四聚体

CMV特异性T细胞频率的检测可以作为肝脏移植后CMV感染或激活的早期诊断指标之一*EBV抗原肽/HLA-I四聚体 移植患者在术后4周，EB病毒抗体为阴性的患者中，可检测到EB病毒特异性的T细胞扩增，可以作为术后EBV感染的检测和诊断指标。*HCV抗原肽/HLAI四聚体 丙型病毒肝炎患者中，与康复的患者比较，慢性肝炎患者白细胞中的特异性CTL数量升高，但功能受损，表现为后者的特异性CTL的增殖能力下降，特异性杀伤能力下降和产生IFN-γ能力下降，而且IL-2不能恢复受损的特异性CTL功能。但是这些患者的流感病毒特异性CTL的功能是正常的。2、研究自身免疫病发生机制*GAD65/HLA-DR4四聚体

65kDaglutamicaciddecarboxylase(GAD65)被认为是IDDM的自身抗原，其中含有DR4结合的免疫显性表位（555-567），外周血标本中GAD65/HLA-DR4特异性T细胞识别相应的抗原提呈细胞提呈抗原肽后，用GAD65/HLA-DR4四聚体和流式细胞仪检测，所有IDDM患者和部分高危个体的标本能够检测到活化的GAD65/HLA-DR4特异性T细胞（CD4+/CD25+），而正常对照组却未能观察到。3、评价肿瘤疫苗的效果例如HLA-I/Melan-A用于免疫治疗方法的评估。4、制备抗原特异性T细胞*流式细胞分选-体外培养法制备抗原特异性的T淋巴细胞：被特定HLA/抗原肽四聚体结合的T细胞克隆通过荧光激活的细胞分选方法分离出来，在体外用传统的方法进行刺激并扩增。*MHC四聚体修饰APC-体外培养法制备抗原特异性的T淋巴细胞：用亲和素-抗B细胞抗体融合蛋白（anti-CD20B9E9-scFvSA）将HLA-I/抗原肽复合物（HLA-I类分子经过生物素化）结合到自身B细胞表面，将经过处理的B细胞作为抗原提呈细胞，与PBMN在体外培养8-14天，仅需一次刺激便可产生特异性CTL。这种方法为体外扩增抗原特异性T细胞提供了有效手段，例如制备病毒抗原、肿瘤抗原特异性的CTL。5、与其他技术联合应用研究抗原特异性T细胞*四聚体技术与细胞内染色技术联合运用能够检测抗原特异性T细胞的细胞周期（活化与增殖）、死亡方式（衰老和凋亡）、效应功能（胞毒能力和细胞因子产生）。有利于研究在各种环境和疾病状态下抗原特异性T细胞的产生、活化和功能，从而揭示细胞免疫应答的机制。T细胞识别配体的多聚化提高了与受体结合的亲和力pMHC四聚体：应用于特异性同种T细胞的检测pMHC二聚体：诱导或抑制特异性同种T细胞图1.pMHC四聚体结构示意图图2.pMHC二聚体结构示意图可溶性pMHC二聚体特异性抑制同种T细胞应答

图7.可溶性pMHC二聚体诱导特异性的同种T细胞耐受的示意图Tyr/HLA-A2二聚体抑制增殖作用具有pMHC特异性图9.增殖抑制反应a,HLA-A2-vePBLsb,HLA-A2-vePBLs与T2/Tyr混合培养c,b+抗原肽Tyr368-376

d,b+HIV/HLA-A2二聚体

e,b+Tyr/HLA-A2二聚体

Tyr/HLA-A2二聚体抑制同种反应体系中

CD8＋T细胞的增殖图8.在T2/Tyr与HLA-A2-vePBLs混合培养体系中，Tyr/HLA-A2二聚体对T细胞的抑制作用具有浓度依赖性，并可被HLA-A2特异性抗体BB7.2阻断。XiufangWeng,MaohuaZhong,ZhihuiLiang,ShengjunLu,XuelingChen,JananLi,JuanHao,FeiliGong,XiongwenWu*.

Peptide-dependentinhibitionofalloreactiveT-cellresponsebysolub