核酸化学3课件

第四节核酸的理化性质一、性状和溶解度1.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂。2.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。3.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。二．核酸的两性性质及等电点1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用四、核酸的变性、复性、分子杂交1、核酸的变性(denaturation)指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。核酸的变性不涉及磷酸二酯键的断裂；一级结构(碱基顺序)保持不变。变性的因素：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂，④射线等DNA的变性(denaturation)方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：①紫外吸收增加（增色效应）：②沉降速率增高；③粘度降低；④生物功能减少或丧失。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂增色效应：（hyperochromiceffect）：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。

。当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。8090100100%50%OD260（254）

Tm变性温度范围①②③℃熔点温度（meltingtemperature,Tm）：DNA热变性过程中，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为熔点温度（Tm）或解链温度、变性温度。实验室常用的方法——热变性一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量。（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm=69.3＋0.41(G+C)

%将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。在适当条件下（退火），变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。2、核酸的复性（renaturation)一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性主要受三种因素的制约：1)将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时（比Tm低25℃左右最佳），可以复性。2）DNA浓度较高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。重复片段越多，复性越快。3）DNA片段的大小：DNA片段越大，复性越慢DNA复性3、核酸的杂交热变性的DNA单链，在复性时可与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，即核酸的分子杂交。DNA-DNA杂交；DNA-RNA杂交。不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源序列。核酸的杂交核酸探针（nucleicacidprobe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。Southernblotting(印迹）将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,

如是否有点突变、扩增重排等。

Northernblotting原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

4、沉降核酸与蛋白质及其他杂质各有不同的沉降系数，在超离心机的强大引力场中，它们的沉降速率差异很大。超离心法可以使核酸与其他杂质分开；也可使不同类型的核酸分开。5、核酸的水解（1）酸或碱水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。在0.1mol/LNaOH中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。2）、酶水解凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）（restrictionnuclease）。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。五、核酸的分离纯化、测定及研究方法（一）分离核酸的一般原则因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。1、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：2、核酸的纯度要求①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。3、核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；③防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。二、核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解

核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。三、核酸的测定方法1、紫外吸收法2、定糖法3、定磷法四、核酸序列测定

DNA的一级结构的测定方法1.Sanger双脱氧链终止法(酶法测序）

DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′,5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。

具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就