DB33T 2287-2020罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程

浙江省市场监督管理局发布CSB浙江省地DB33方标准DBT2287—2020前言T浙江省农业农村厅提出。由浙江省水产标准化技术委员会归口。草单位：浙江省淡水水产研究所。引言效性和范围无任何立场。人：浙江省淡水水产研究所罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测规程-1检测程序的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。标准适用于罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测及关联疾病的流行病学调查、诊断和监测。范性引用文件，GBT682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SCT03水生动物产地检疫采样技术规范SCT02.1斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法定义taihuvirus，MrTV)，属于小RNA病毒目、双顺反子病毒科、急麻病毒属，病毒粒子为无囊膜的直径约30nm的二十面体球形颗粒，核酸类型为单股正链RNA，长度约10.3kb。其主要侵染罗氏沼虾幼体甲壳下上皮组织和神经节，造成肝脏和结缔组织出现强嗜碱性细胞质包涵体。4缩略语。bp：碱基对(Basepair)DEPC：焦乙酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate)DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dATP：脱氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸(Deoxycytidinetriphosphate)dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate)dNTP：脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dTTP：脱氧胸苷三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)EB化乙啶，核酸染色剂(Ethidiumbromide)achiumrosenbergiidicistrovirusMrTV：罗氏沼虾太湖病毒(Macrobrachiumrosenbergiitaihuvirus)M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus)RdRp：RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase)RNA：核糖核酸(Ribonucleicacid)RNasin：核糖核酸酶抑制剂(RNaseinhibitor)RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)Taq：水生噬热杆菌(Thermusaquaticus)程序流程图和材料9.LTaqDNA聚合酶：5U/L，－20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。GTAGAGCGTGGAGGAGTAAAACACTATCTCTGTCTTCGAGGGATTTTCTATTTCGGCTCGCGAATTAGGGAGAGGLLZ最低可设定温度－86℃。Lt研磨器。LV安全柜或超净工作台。L控温水浴锅或加热模块。LL移液器。L泳仪。LL平电泳槽。LLL透射仪或凝胶成像仪。LLZ炉。操作步骤L样品的准备SCTSCT1的规定。4琼脂糖电泳鲜活幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约30mg~50mg(去掉稚虾眼)；成虾取约30mg~mg－20℃。2RNA模板的提取L8.3RT-PCR操作.3.1cDNA合成对每一份样品，在一支无RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5L10M引物MrTV572R1，2.5L无NA L5×M-MLV逆转录酶缓冲液、1LRNasin(40U/L)、0.5L10mmol/LdNTPs、0.5LM-MLVrTVFLMMrTVRLTaqDNAULc7分钟。LMMrTVFLMMrTVR2、1LTaqDNA聚合酶(5U/L)、41.0Lc7分钟。用1×电泳缓冲液(1×电泳缓冲液的配制按附录A中A.3进行)配制2%的琼脂糖凝胶(含0.5g/mLBAA缓冲液刚好淹没胶面，将5LPCR扩增产物和1L6×载样缓冲液(6×载样缓冲液配制按附录A中A.5拍照记录。9结果判定题排除PCR增：阳性对照和阳性照在572bp处无任何条带，以无RNA酶水为模板设立的空白对照无任何条带第二轮PCR扩增：阳性对照在472bp处会有特定条带出现；阳性样品在在472bp处无任何条带，以无RNA酶水为模板设立的空白对照无任何条带出3．逆转录产物成份抑制PCR。产物或纯化cDNA。阴性对照组或空白对照组在第一PCR72bp处有特定条带；第二次PCR扩增后在472bp处有条带出及所用仪器设备。题排除APCR介入。2.检查逆转录和PCR试剂，重新合成性对照和样品出现较多杂带或明显的1．未注意低温操作，使PCR出现非特2．酶活性变化、dNTPs浓度变化或10混物制备的准确性、试剂质EB量，将琼脂糖凝胶置于清化乙锭(EB)。A(规范性附录))RNA在无RNA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1.0mL/支分装于无RNA酶的1.5mL微量离心管中，保存于A.2无RNA酶的水水PCmLRNAA.31×电泳缓冲液s5mol/LEDTA(pH8.0)A.410mg/mLEB贮存液水A.56×载样缓冲液40g(规范性附录)B般介绍外源性的RNA酶污染是指来自于水、玻璃制品、塑料器皿、电泳槽、操作人员和微生物等。可通过DEPC本附录主要介绍外源性RNA酶的消除方法。B液配制CDEPCTris应使用经DEPC处理的水配制，然后经无RNA酶的0.22m微孔滤膜过滤除菌。B璃制品金属制品也可按玻璃制品的办法处理。B丙烯塑料制品DEPC的水中浸泡12小时，然后经高压蒸汽灭菌，最后烘干。B工操作落尘带入RNA酶的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在超净工作台中进行操作。B微生物污染(资料性附录)(GeneBank登录号：NC_018570)ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTTMrTV572F1MrTV472F24642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942AGGAGGATATTGCTAGTGCTATGCCCACAACTCATGCAGGACGAGTTTC