硝基四氮唑蓝还原试验课件

硝基四氮唑蓝还原试验NitroblueTetrazoliumReductionTest实验原理

这是用于检查机体细胞免疫功能的一种方法。硝基蓝四氮唑，又称四氮唑蓝(nitroblue

tetrazolium，NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，当其被嗜中性粒细胞的酶还原后，则变为非水溶性的蓝黑色甲臜(Formazan)颗粒，沉淀于胞浆内。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时，嗜中性粒细胞的吞噬能力明显增强，还原NBT的能力亦随之增高，但病毒性感染或非感染性疾病则不增高，故可利用NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性粒细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。白细胞根据形态差异可分为有颗粒和无颗粒两大类，无颗粒的白细胞有淋巴细胞和单核细胞两种。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏-吉姆萨染液可分辨出三种颗粒白细胞即嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。绝大部分的粒细胞是嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞，简称中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte），是白细胞中数量最多的，约占全部白细胞的50％左右，呈圆形，胞质淡红色，内含有多量的紫红色微粒（不易看清）。胞核随细胞成熟的程度而不同，幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见，老龄的有8－9叶或更多。嗜碱性粒细胞，数量很少，约占0.6％，大小与嗜酸性颗粒细胞基本相同。胞质内含有大的蓝紫色颗粒，胞核也分叶。主要试剂与器材1、待测样本：新鲜肝素抗凝血；2、NBT溶液：取NBT0.2g和聚蔗糖20mg，溶于100ml生理盐水中，过滤，分装，4℃保存备用；3、肝素溶液；4、瑞氏-吉姆萨染液，甲醇，pH7.2PBS，生理盐水等；5、主要器材：采血针，75%酒精棉球，载玻片，湿盒，37℃恒温箱，显微镜等实验操作方法1、载玻片上滴加20-30ul肝素溶液；2、75%酒精棉球对受试者手指尖消毒，干燥后用采血针针刺，轻柔挤出血，吸取约40-60ul血液，与载玻片上的肝素混匀；3、加入NBT溶液一滴，轻轻吹吸混匀；4、置于湿盒中，放入37℃恒温箱孵育15min后，转至室温再放置15min，并轻轻摇匀；5、将载玻片上的待检样本制成血涂片（采取推片法），自然晾干；6、滴加瑞氏-吉姆萨染液染色，具体步骤如下：1）平置血涂片于桌面或染色架上，滴加试剂一3-5滴，使其迅速覆盖血膜，染色1分钟，与固定血膜；2）不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二6-10滴，轻摇玻片使染色液充分混匀，染色5-8分钟；3）水洗后，待干后镜检。注意事项1、推片：取反应溶液1-2滴置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30°角，置于溶液正前方，稍往后移与溶液接触，可见溶液沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳前移，至溶液铺完为止；2、涂片时不要太厚也不要太薄，太厚时红细胞容易重叠并易皱，太薄时又不容易找到白细胞；3、血溶液要干透后才能染色，否则染色时血膜容易脱落；4、染液一和染液二不能过少，以防染液蒸发引起染液沉淀，染液一不可少于400ul，染液二的量是染液一的2倍，滴加染液一和染液二时要轻摇玻片，时溶液迅速布满血膜或使染液迅速而充分地混合；5、镜检时如果红细胞偏蓝，请放在蒸馏水中1-3分钟，直至红润为止；6、如果染色过淡，可复染；染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用75%的乙醇脱色3-5秒钟后，再镜检观察；7、沉着的甲臜颗粒形状不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。涂片要均匀，以便清楚地看到甲臜沉着物，并能更好地区别嗜中性白细胞及单核细胞。因为单核细胞还原NBT的能力也很强，不应将其计算在NBT阳性细胞内。免疫小鼠抗血清的制备1、采用眼球放血法，每组收集2只免疫小鼠的所有外周血至一洁净干燥的小平皿中，不要放抗凝剂！2、盖上平皿盖，斜置于4℃冰箱，过夜，待血清充分析出；3、第二天，收集析出的免疫小鼠抗血清，注意要适当剥离和破碎凝血块，充分收集血清至一干净的1.5mlEp管；4、2500