基因的克隆方法大全课件

第三章基因的克隆方法1前言

基因是生物染色体上的一段DNA序列，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。2基因的表达过程mRNA翻译成蛋白质基因组DNA3一、基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成蛋白质1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因5原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。1、蛋白质序列克隆法6实用性：分离纯化蛋白质十分困难CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA

C

T

GATG

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G

T

T

C据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！密码子有简并性现象！7差减杂交（SH）抑制性差减杂交（SSH）差异显示PCR（DDRT-PCR）DNA代表性差异分析（DNARDA）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）cDNA微阵列已发展的相应基因克隆方法：9

差减杂交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。超声波打断雌鼠的DNA（过量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA

(XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的应用机理：

!!不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。特异表达基因的样本（TS）无特异表达基因的样本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子111.2.2抑制性差减杂交（SSH）Tester样本mRNADriver样本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合，变性杂交过量ABPCR扩增5`3`13应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照141.2.3差异显示PCR（DDRT-PCR）最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA1517具体操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反转录；3、特定引物和RP结合RT-PCR；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。18缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。19二、基于基因加标签的基因克隆方法原理：主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。21外源DNA基因组染色体DNA基因A产生突变型分类：T-DNA标签法转座子标签法。22T-DNA标签法克隆基因技术路线：农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。23转座子标签法转座子又称转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。25转座子标签法最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和spm因子，后者如果蝇的copia因子。26三、基于基因序列的基因克隆方法根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过PCR扩增基因法291、通过分子杂交克隆法原理：根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因。301）直接从基因组中扩增过程：（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增及产物鉴定2、通过PCR扩增基因法原理：

根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用PCR技术直接从生物的基因组或是cDNA中扩增出目的基因。31提取基因组DNAPCR引物设计真核生物基因组含有内含子！此法适合扩增原核生物基因。PCR扩增基因序列分析32（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增及序列分析（3）根据目的基因序列设计引物2）从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。334、基于基因图谱的基因克隆方法又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。34染色体分子标记A分子标记B目的基因阳性克隆转化互补实验基因图位克隆示意图35图位克隆基因的一般操作过程：通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记筛选基因组文库，构建包含目标基因的基因组物理图谱。目的基因标记1标记2标记3标记4标记536染色体分子标记2分子标记3目的基因基因组物理图谱进一步精细定位获得目的基因37通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。基因序列测定及表达分析等。38影响基因图位克隆的因素：建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。基因组文库的大小及单克隆的大小。成功的例子：水稻Xa21拟南芥的RPM1，RPS2等。39