实验1大肠杆菌的培养和分离课件

实验1：大肠杆菌的培养和分离微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生生物特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：

(一)微生物大肠杆菌（E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的_____中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入__________都会对人体产生危害。大肠杆菌是_______工程中被广泛采用的工具。肠道泌尿系统基因革兰氏______（填阴或阳）性菌阴代谢类型：异养，兼性厌氧型生长适宜温度：质粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA连接酶、受体细胞37℃左右大肠杆菌酵母菌放线菌霉菌菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鉴定菌种的重要依据。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。菌落的概念白色或乳白色，光滑大肠杆菌菌落：芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.一、基础知识：（二）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌

不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物

加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。培养基的用途液体培养基：增菌，常用于发酵工业固体培养基：增菌，菌种保存及分离纯化、鉴定菌落、活菌计数等半固体培养基：动力检测，保种不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节pH2、成分水、碳源、氮源、无机盐、生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：5～6细菌：6.5～7.5有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压比较消毒与灭菌比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒灭菌较为温和部分生活状态的微生物不能能全部微生物强烈高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）洒精灯灼烧灭菌干热灭菌（1）灭菌方法：3、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具100kPa、121℃下维持15-30min需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿160-170℃下加热1-2h接种环等金属器具请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克，氯化钠0.5克，水50ml（配固体培养基再加琼脂1克）溶解计算称量调pH分装加塞，包扎2、流程二操作步骤灭菌倒平板①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用__________。②加塞：试管用塑料盖或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或报纸封口。③包扎：用________或报纸三角漏斗棉花塞封口膜6层纱布牛皮纸牛皮纸高压蒸气灭菌法④灭菌1）加水：2）装锅：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是_________.物品放置的要求______________________：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_______内。再以________方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。不触及内胆整齐、稳定、留出空隙排气槽两两对称倒平板：待培养基冷却至_____℃时，将每只培养皿倒入_________ml未凝固的固体培养基，置于_____位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。_______备用。制斜面：将未凝固的固体培养基的试管____放，冷却待凝使即成为斜面。６０10～12水平倒置斜⑤倒平板、制斜面操作平台：灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_________和___________，灭菌30min.过滤风紫外线超净台思考题：A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。（三）平板划线分离法主要器具：操作过程：注意：无菌操作方法：同前。将培养皿______（盖在下），放于_____℃恒温培养箱中培养__________小时。在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始________划线。接种环、思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？恒温培养箱。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。末端１２～２４倒置３７平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？

操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。（四）稀释涂布平板法主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作过程：先将培养菌液稀释（10-5~10-7倍）用移液管或吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。在适当稀释度下，可培养得到相互分开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于３７℃恒温培养箱中培养１２～２４小时。划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。10g土样从土壤中分离微生物稀释涂布法（五）斜面接种及菌种保存主要器具：操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取___菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在_____上，_____℃恒温培养箱中培养____小时后，____℃冰箱保存。无菌操作：同前试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？接种环、恒温箱、冰箱单斜面３７２４４菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法思考题？利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可以进行植物组织培养。请简要说明这两项技术应用设计思路的相同点以及区别。相同点：都是从培养对象所需的营养条件出发，配置适宜培养基。都要求严格的无菌条件。不同点：植物组织培养往往还要加入激素。例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量D编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例2．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是

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