分子诊断大题复习参考

基因分类：A・按功能：1■结构基因编码蛋白和酶分子结构（蛋白基因）；2■调控基因（RegulatoryGene）调节结构基因表达，包含调节基因、操纵基因和启动基因；3■转录而不翻译的基因（RNA基因）：rRNA基因-rRNA-核仁形成区，核糖体组成。tRNA基因-tRNA-转运氨基酸。B・按重要程度：1■看家基因（House-keepingGene）:维持细胞最低限度功能所不可少的基因，如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进行表达。2■必需基因（EssentialGene）:突变时会引起致死表型的基因.人类单核苷酸的多态性（SNP）的特点及主要用途有哪几个方面？1、疾病的连锁分析与基因的定位：包括复杂疾病（如骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病、精神性紊乱、各种肿瘤等）的基因定位、关联分析，并可用于遗传病的单倍型诊断。2.指导用药和药物设计：SNP多态性能充分反映个体间的遗传差异。通过研究遗传多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性，可以阐明遗传因素对药物效用的影响，从而对医生针对性的用药和药物的开发提供指导和依据。3、用于进化和种群多样性的研究:生物界的进化及进化过程中物种多样性的形成与基因组的突变和突变的选择密切相关，构建整个基因组的SNP图谱对于直接研究人类的起源、进化具极大意义。对比人群之间SNP图谱的异同情况可以对人类的起源、迁移等作出估计，从而理清人类进化过程中源与流的问题。基因表达的特点：A时间特异性，单细胞生物：特定基因表达严格按特定时间顺序发生。多细胞生物：基因表达在不同的发育阶段严格按特定时间顺序开启或关闭。又称为阶段特异性（Stagespecificity）。B,空间特异性，在某发育阶段，同一基因在不同组织器官其表达有差异。又称为细胞特异性（Cellspecificity）基因表达的方式:A组成性表达，某些基因的表达不受内外环境的影响，在个体生长过程中，几乎在所有的组织中持续表达或变化很小。这些基因一般为看家基因(Housekeepinggene)B,诱导和阻遏表达，诱导(Induction):基激而表达受到抑制和减弱C,协调表达，在一定控制机制下，功能相关的一组基因进行协调共同表达。蛋白质间互作鉴定:（1） 蛋白质亚基的聚合：线性、环状、螺旋、球状、交叉聚合（2） 分子识别：抗原与抗体、配体与受体、酶与底物（3） 分子的自我装配：核糖体、细菌鞭毛、病毒的自动装配（4）多酶复合体：丙酮酸脱氢酶复合体包括丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶。蛋白质相互作用的研究方法：体外：（1）肽蛋白质亲和层析；（2）亲和印迹；（3）免疫沉淀;（4）交联等。

体内：（1）酵母双杂交系统；（2）噬菌体展示技术；（3）生物传感芯片质谱；（4）蛋白质定点诱变。蛋白组学研究内容：1■蛋白质分离；2■蛋白质的鉴定；3■蛋白质-核酸间相互作用；4■蛋白质与蛋白质的相互作用。蛋白质组研究常用技术：1）蛋白质分离技术（电泳和层析技术）；2）蛋白质检测与像分析以及鉴定技术；3）蛋白质互作研究技术；4）生物信息学分析技术。核酸的分离与纯化原则:保证核酸序列结构完整性，防止降解和结构破坏（酶降解防止措施:A・DNA酶抑制剂;B.阴离于型表面活性剂SDS；C.RNA酶（RNAase）抑制剂）；剔除其他物质，保证纯度（主要是去除非核酸大分子物质:蛋白质多糖及脂类非需要的核酸分子；去除分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子）。核酸分离与纯化的路线设计和主要步骤:核酸释放一一细胞的破碎；杂质的沉淀与分离；核酸的沉淀、洗涤.干燥；核酸的鉴定与保存。。核酸释放:物理方法：高速组织捣碎机捣碎;玻璃勻浆器匀浆;超声波处理法;处理法;液氮研磨法;A1203粉末研磨法化学法：化学处理法（SDS、LDS，吐温80等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）核酸杂交技术的原理：核酸杂交技术中，一条单链是待测序列（DNA或RNA）,另一条是“探针（probe）”--带有可检测标记、且与待测序列具有同源性的一段核酸序列；杂交后洗脱除去未结合的和非特异结合的探针，特异性结合的探针所在位置便是待测序列所在；通过检测探针上的标记，可实现对待测序列的定性、定量或定位分析。影响杂交的因素：1）核酸分子本身⑴分子大小：分子越大，扩散速度越慢，单链分子间发现互补序列和复性的速度就越慢（2）核酸浓度:浓度越大，复性速度越快。因互补链之间相互碰撞的机会越大⑶核酸序列的复杂性：序列越简单，越容易相互识别和快速复性。2）外在素1）温度（2）离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定（3）甲酰胺：降低核酸的Tm值和杂交液的温度（4）非特异性杂交反应：杂交前，封闭非特异性杂交位点减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉核酸杂交的基本步骤：1）待测核酸分子与固相介质的结合和固定即核酸分子的转移和固定：常用毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法2）预杂交（封闭非特异位点）3）探针变性（单链者勿需）4）杂交（探针寻找与其互补的序列并结合）5）洗膜（除去未结合探针和非特异结合探针）6）杂交信号的检测理想的固相支持物应具备的特性：①较强地、牢固地结合核酸分子；②不影响杂交反应；③非特异吸附少；④具有良好的机械性能。常用的固相支持物①硝酸纤维素膜（NC） 优点：杂交信号本底低缺点：DNA分子结合不牢固，尤其小分子；脆性较大②尼龙膜优点：结合单链、双链DNA的能力比NC强；耐用缺点：杂交信号本底高③化学活化膜 优点：DNA与膜共价结合对不同大小的DNA片段有同等结合能力缺点：结合能力不及上述两者分子杂交的基本方法:SouthernBlot（Southern印迹杂交）/NorthernBlot（Northern印迹杂交）/斑点及狭缝印迹杂交（DotBlot）/原位杂交（insituhybridization）/液相杂交/生物芯片技术Southern印迹的主要步骤:待测DNA样品的制备、酶切/待测DNA;样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳；凝胶中DNA的变性：碱变性；Southern转膜：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜/毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法；探针的制备；预杂交、杂交、洗膜；杂交结果的检测TaqMan探针：在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5囑标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3’端标有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3^5’外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收从而产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。基因组探针和cDNA探针定义及共同优点：（基因组DNA探针：）为某一基因的全部或部分序列。缺点：真核基因组含有内含子序列；因此，当其用于检测基因表达时，杂交效率低。（cDNA探针：）从已构建的cDNA文库中筛选和分离出来的靶基因序列。cDNA探针无内含子序列，尤其适用于基因表达的检测，目前应用最广。优点：①制备方便：克隆于质粒载体中②稳定：DNA探针较RNA探针稳定；RNA易被RNA酶降解③标记方法成熟和多样。共同缺点：双链探针存在自身复性，影响杂交效率。RNA探针的优点：单链：杂交时不存在第二条链的竞争（自身复性），杂交效率高；含RNA的杂交体更稳定（Tm更高），杂交反应可以在更为严格的条件下进行，因而RNA探针杂交的特异性高主要缺点：探针不稳定，易被RNase降解。RNA探针适合于:Northern杂交、原位杂交等。寡核苷酸探针的优点：①短，故而杂交的速度快（较长的探针）；②制备方便:可在短时间内大量制备；③可合成单链探针:避免了自我复性，提高杂交效率；④合成与标记同时进行；⑤适合于放射性和非放射性标记物的标记 缺点：灵敏度稍差理想的探针标记物应该具备的特点：高灵敏度、低假阳性率和高化学稳定性；不影响被标记核酸分子的主要理化特性、杂交反应的特异性和杂交体的稳定性；标记方法和检测方法均简单；对环境无污染，对人体无损伤；价格低廉。常用的探针标记物常用非同位素标记物①酶:碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化物酶（HRP）。直接：标记探针；间接：标记与探针特异结合的物质（抗体，配体等）。②生物素③地高辛：Dig-11-dUTP④荧光素非同位素标记物优点：稳定性和分辨率高；检测时间短；操作简便；无放射性污染，不需特殊的防护设备;使用期长。缺点：敏感性不如同位素标记；特异性还不够理想。同位素（核素）优点：与相应元素的化学性质完全相同，对碱基配对的特异性和稳定性无影响；通过放射自显影检测银粒的多少，易于定量分析；灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测；特异性强，假阳性率低；易于去除旧探针，重复检测靶分子；方法简便。主要缺点：射线对人体有伤害；放射性物质需特殊的处理；半衰期短,使用期有限；检测时间长（自显影需1-15天）。聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针:利用TaqDNA聚合酶和标记的dNTP,以少量的起始模板合成大量、高比活的双链或单链DNA探针；可在1~2h之内大量合成探针DNA片段，并且探针DNA在合成过程中可得到很好的标记；一边合成，一边标记，全长标记。RNA的分离与提取：难点：RNA在体外十分不稳定，易降解，不易得到全长；RNA酶在体外存在于手汉、唾液.呼吸、灰尘中。原则：防止污染、防止降解。防止方法：高压灭菌；器皿：200°C烘烤2h；试剂：采用焦碳酸二乙脂（DEPC）处理；戴手套、口罩。提取方法：（1）异硫酸胍-酚氯仿法：异硫酸胍（4M）+巯基乙醇(0.14M)为蛋白质变性剂，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤(2)TRIzol法：TRIzol(苯酚+硫氰酸化合物)+氯仿+异丙醇+75%乙醇(3)酚-氯法。纯化方法:饱和酚(pH4.5-5・5)原位杂交的基本原理：样本经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与组织、细胞中待检测的核酸进行特异性结合形成杂交体，然后通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下对待测核酸进行细胞内定位的方法。根据核酸探针的序列特点，可将FISH探针分为三大类：重复序列探针、单一序列探针和全染色体涂抹探针。重复序列探针(repetitivesequencesprobes)是指与某条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。一般来说，不同的染色体，着丝粒重复序列中的核苷酸序列也不同，但端粒重复序列不具有染色体特异性。单一序列探针(Uniquesequenceprobes)与某条染色体上特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交。包括带特异性探针(bandspecialprobes)和基因座特异性探针(LocusSpecificprobes等。全染色体涂抹探针(wholechromosomepaintingprobes,WCP)是识别一条特定染色体全长上的单一序列探针的混合物。荧光原位杂交或染色体原位杂交:利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它通过荧光标记的探针与待测标本的互补核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对杂交信号的大小、数目、定位和分布等进行分析，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断多重荧光原位杂交(M-FISH)原理:混合数种荧光原色，形成不同颜色荧光探针，在一次杂交中使每一条染色体都涂上不同的颜色，可同时观察全部染色体PCR原理：①在第一个反应周期中，以2条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段②进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要与新合成的链（长产物片段）结合；引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就使这次延伸的片段的3'端有了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。因此，“短产物片段”是按指数级倍数增加，而长产物片段则以算数倍数增加，几乎可以忽略不计。PCR技术的特点：（1）高度的灵敏性（2）高度的特异性：PCR的特异性决定因素（3）对标本的纯度要求低：血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA（4）重复性好（5）用途广泛PCR检测技术有何临床应用。（1）PCR在病原微生物的检测中的应用；（2）PCR在遗传病中的应用；（3）PCR在肿瘤中的应用；（4）其它方面的应用PCR技术除用于临床诊断和治疗外还可用于DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。常规PCR与FQ-PCR的对比：常规PCR:①其测定点则为PCR扩增的平台期，对PCR扩增的终产物进行定性和半定量分析；②不能实时监测扩增反应；③不能对起始模板准确定量ooooFQ-PCR:①利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化；②通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析；③其测定点为PCR扩增的指数扩增期，避开扩增“平台期”；④常用外标法DNA的变性与复性反应过程--一三步曲①高温变性：在高温（95「C）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板②低温退火：在低温（37~55C）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链③适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72C）下，以引物的3'端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5^3'方向延伸，合成DNA新链标准反应体系（五要素）：（1）DNA模板（template）:靶基因（2）原料：dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）（3）催化酶：耐高温的DNA聚合酶（如：Taq酶）（4）一对引物（primer）:扩增序列的决定者，其与靶基因两侧序列互补（5）Mg2+和Buffer如何提高PCR扩增的特异性？①升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性②缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会③降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发④改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性⑤引物设计的特异性⑥减少循环次数⑦热启动（HotStart）:即首先将模板变性，然后在较高温度时加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严格性，使扩增更特异⑧采用两对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。PCR-SSCP:单链构象多态性，该分析适合基因突变的大规模筛查。即单链DNA由于碱基序列不同引起的构象差异，可致相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。PCR-SSCP原理：单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使其发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力大小不同，迁移率就不同。因此，通过非变性PAGE，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。基本过程：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量单链DNA进行非变性PAGE④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。PCR衍生技术（per技术有哪些）逆转录PCR、反向PCR、巢式PCR、标记PCR、多重PCR、原位PCR、不对称PCR、定量PCR、锚定PCR（1）加端PCR（add-PCR）:即让扩增产物的5'-末端带上一段特殊的、满足需要的DNA顺序的PCR。 目的：使PCR产物带上特定功能或用途的DNA片段，如特殊酶切位点.启动子、点突变等。方法：在设计其引物时，除与模板配对的那一部分外，再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外的一段DNA，末端可加碱基的数量约为十几个到几十bp。（2）原位PCR（InSituPCR）:在组织细胞内进行PCR扩增，通过标记引物直接显色或采用原位杂交进行检测，可揭示该特异序列在细胞中存在的量和部位。可用标本：新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等基本步骤：①固定组织或细胞：多聚甲醛处理；蛋白酶K消化处理，适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入；PCR扩增：加PCR反应液在组织细胞片上，覆盖液体石蜡后，进行PCR；④直接显色：显色扩增产物情况，或原位杂交：PCR后行原位杂交检测扩增的靶序列情况；⑤显微镜观察结果优点：具有定位能力的原位杂交++高度特异和敏感的PCR①既能鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置（细胞内定位）。是细胞和分子水平研究以及临床细胞学诊断领域里的一项有较大潜力的新技术，尤适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。②其特异性和敏感性高于一般的PCR:勿需分离提取待测靶序列、杂交的放大作用等。（3）逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）原理：在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA；再以后者为模板，进行PCR反应；如此，低丰度的mRNA得以扩增放大（pg到ng、pg），显著提高mRNA检测的灵敏度。用途：分析基因的转录水平（半定量）；用于基础研究；临床常用于基因表达、RNA病毒的检测；获得目的基因，用于重组DNA技术；制备cDNA探针，用于杂交和芯片技术。RT-PCR具有半定量的功能：选用管家基因mRNA作为内参，管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录，再在各自的特异引物引导下，以cDNA为模板扩增，计算出扩增后目的cDNA/管家基因cDNA的比值，从而达到半定量的目的。半定量RT-PCR的不足：①由于管家基因的mRNA与靶基因使用不同的引物，两种mRNA在序列、大小及二级结构上可能亦存在较大的差异，使两者的扩增效率存在差异，从而影响定量的准确性；②不同来源的组织或细胞的mRNA可能有着不同的逆转录效率，这种逆转录效率的差异在随后进行的PCR中被百万倍地放大（当比较不同细胞中某基因的表达时）。（4）反向PCR（reverseORinversePCR）:是用一对反向引物来扩增两引物以外的（vs—对引物间）、未知的DNA片段，即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用途：研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，故又可称为染色体步移（ChromosomeWalking）；制备对未知序列的探针。（5）不对称PCR（asymmetricPCR）:最初的10-15个循环中的主要产物是双链DNA;但是，当低浓度的引物（限制性引物）被耗尽后，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果便产生大量单链DNA（ssDNA）;另一方法:先用等浓度的引物进行PCR扩增，制备双链DNA（dsDNA）;再以此dsDNA为模板、其中一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA。目的：获得大量单链的靶DNA片段用途：制备DNA测序的模板；制备杂交探针方法：采用不同浓度的一对引物（分别称为限制性引物和非限制性引物），其最佳比例一般是0.01:0・5pM（1:50-100,关键是限制性引物的绝对量）（6）多重PCR（multiplePCR）目的：检测一组特定基因序列的存在或缺失原理和方法：在同一反应体系中加入多对引物，以扩增同一模板的多个区域（同一基因内或不同基因中的多个部位）。结果：如果其中某一区段缺失，则电泳图谱上该条带就会消失。 意义和应用：1）同时检测多种病原体或鉴定是哪型病原体感染可组合系统的有:①肝炎病毒的感染：在同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，如甲乙丙型肝炎病毒重叠，或甲乙型肝炎病毒重叠，或乙丙型肝炎病毒重叠②肠道致病性细菌的检测：如伤寒，痢疾和霍乱，它们可表现出相同的肠道症状，并且有时痢疾、霍乱可同存一病人，并同时发病③性病的检测：如梅毒、淋病及艾滋病④战伤细菌及生物战剂细菌的检测：如破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、炭疽杆菌、疫杆菌等2）用于检测疾病相关基因十分庞大的疾病：如视网膜母细胞瘤、进行性肌营养不良症等。这些疾病的相关基因上常有多处缺失或突变，且彼此相隔数十或数百kb，常规PCR技术难以同时扩增它们。特点：①高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体②系统性：多重PCR很适宜于成组的病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时检测③经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间、试剂（7）巢式PCR（nestedPCR）:用两对PCR引物扩增一完整DNA片段，以提高检测的灵敏度和特异性。 第一对引物（外引物，outerprimer）:其对应序列在模板的外侧；其扩增片段与普通PCR相似；第二对引物即巢式引物（内引物，innerprimer）它结合在第一次PCR产物内部，其扩增片段短于第一次扩增产物。 过程：第一轮:外引物，原始模板，15-20循环的标准扩增；第二轮：巢式引物（内引物），将一小部分上轮扩增产物稀释100-1000倍作为第二轮的模板或者通过凝胶纯化选择所需大小的扩增产物作为新的模板,15-25个循环第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，即真正的靶序列特点：①两对引物、两轮扩增使该扩增反应尽管总循环数依然有30-40，但是却几乎不受平台效应的影响，扩增效率高，提高检测的灵敏度②更高的特异性：能够同时与两套引物都互补的靶序列应该很少很少③也可采用同一反应管的巢式PCR:主要利用内外引物的Tm值不同。外引物的退火温度高于内引物退火温度，即一次操作，两次PCR扩增，可减少交叉污染机会（8） 标记引物的PCR:用荧光素等标记PCR引物，以便直观地检测目的基因。用不同颜色的荧光染料分别标记不同引物，同时扩增这几个DNA区段，电泳后各扩增产物呈不同颜色荧光，也称彩色PCR；如果某一区带缺失，则会缺失相应的颜色此法只是定性检测PCR产物，用于检测基因突变、染色体重排或转位、基因缺失及微生物分型等特适合临床标本的基因诊断（可同时检测多种基因）（9） 锚定PCR目的和用途：用于扩增已知一端序列的DNA方法：①先在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴；②一引物为多聚dC（锚定引物，PolydC。为保证扩增特异性，一般应在12聚以上）；③另一引物与已知序列互补；@PCR（10） 菌落PCR:不必提取基因组DNA，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，通常利用此方法进行重组体的筛选，省时省力建议使用载体上的通用引物PCR产物大小是该通用引物之间的插入片段大小（11） LAPCR:一般PCR扩增可达3000bp，难以扩增大于5000bp的片段。其关键在酶！使用具有3'務核酸外切酶活性，即有校对活性的耐热性DNA聚合酶，产物既长又高保真。LA-PCR成功扩增策略：①多种耐热DNA聚合酶如TaqDNA聚合酶和Pfu或TliDNA聚合酶混合使用；②缩短变性时间（减少对DNA模板的损伤）：20s;③增加延伸时间:可达10一20分钟，依模板长度而定。（12） 荧光定量PCR（FQ-PCR）（realtimefluorescentPCR,实时荧光PCR）:在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号监测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对起始核酸模板进行定量分析。即对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行实时检测、定量。（13）降落PCR:指的是每一个（或n个）循环退火温度逐步降低1度，直到达到一个较低的退火温度。退火温度的起始温度:（Tm+10-15度），在接下来的循环中，退火温度每个循环降低1・2度（一般为1度），直到（Tm-5度）。该方法主要用于避免非特异性PCR产物的出现Sanger双脱氧链终止法，全称：双脱氧链末端合成终止法原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立4种互相独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）作为链延终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5'到3'方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。每个测序反应体系的组成：1.DNA聚合酶；2■单链DNA模板（待测片段）；3■带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物；4・Mg2+;5■原料-dNTPs(dATP,dGTP,dCTP和dTTP);6■终止剂-ddNTPs(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)测序体系的关键成分：（1）链终止剂，2',3'-二脱氧核糖核苷酸（ddNTPs）（2）用于测序的变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）胶长40cm，厚度均勻；4-8%丙烯酰胺；7mol/L尿素 （3）模板，即待测序的DNA片段（4）引物。酶促测序反应中，利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物（5）DNA聚合酶（6）放射性同位素标记的dNTP:a-35S-dNTP焦磷酸测序技术（PSQ）:在以靶DNA链为模板指导核酸合成的过程中，将释放的可见光作为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法，是一种合成测序

技术。原理：同一反应体系中由四种酶催化的级联化学发光反应，首先让测序引物与待测模板结合成杂交体，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中，并释放出等摩尔的焦磷酸基团(PPi)，PPi最终转化为可检测的光信号，并由PyrogramTM转化为一^峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，随后，加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。产生的荧光信号自动传入分析系统，直接测读靶DNA序列。特点：1■无需电泳，也无需荧光标记，操作极为简便，具快速、准确、经济和实时；2■阅读能力已从100bp至400bp；3■该技术具有多种不同的用途。简述重组DNA技术的原理及技术。重组DNA是在体外利用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA片段与载体连接从而组成一个新的DNA分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA片段。经重组的DNA分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。大致步骤包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与运载体连接成重组DNA;④重组DNA导入受种细胞；⑤重组体的筛选。EI生物芯片的分类：(1)基因芯片(genechip):又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray)，是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成(2)蛋白质芯片(proteinchip或proteinmicroarray):是将蛋白质按微阵列方式固定在微型载体上获得(3)细胞芯片(cellchip):是将细胞按照特定的方式固定在载体上(4)组织芯片(tissuechip):是将数十、数百甚至上千的组织切片按照特定的方式固定在载体上，用免疫组织化学.原位杂交.FISH等技术分析组织内成分的差异EI生物芯片技术的特点：1）高度交叉的综合性新技术；2）高度集成性、微型化和连续化；3）高通量；4）通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法，可使该技术具有多种不同的应用价值。（生物芯片技术的主要特点：高通量、集成化、并行化、自动化、微型化、应用广、低成本）简述蛋白芯片的原理及应用。蛋白质芯片制作和检测的基本流程A:芯片的制备B:样品的制备C:蛋白探针与待测分子相互作用D:信号检测和分析。。。。蛋白质芯片的基本原理是采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于固相介质上形成的生物分子点阵，在待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析。蛋白质芯片是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面,从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成份进行高通量检测。 蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、高通量、并行、微型化和自动化的蛋白质分析技术，适用于分析包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品能分析包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，灵敏度高达pg/ml。基因芯片技术/检测的原理和步骤：原理：将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的待测样品进行杂交，通过检测杂交信