植物外源基因转化方法及转化子的检测

植物外源基因转化方法及转化子的检测第1页，共56页，2023年，2月20日，星期五1.概述人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类所需要的新品种或新物种。外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。第2页，共56页，2023年，2月20日，星期五2.植物基因转化的受体原生质体悬浮细胞胚性愈伤组织胚状体叶片切块其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等第3页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.植物转基因的方法外源基因的间接转化法（载体介导法）农杆菌介导法病毒介导法外源基因的直接转化法化学诱导DNA直接转化物理法诱导DNA直接转化花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）

第4页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.1农杆菌介导法农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti(Tumerinduce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。第5页，共56页，2023年，2月20日，星期五根癌农杆菌（Ti质粒）Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，Ti质粒具有五个主要功能区域，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeats)，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。

Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。第6页，共56页，2023年，2月20日，星期五植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用土壤农杆菌的毒性区基因被激活T-DNA的切割和T复合物生成T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入植物细胞T-DNA整合到植物染色体上第7页，共56页，2023年，2月20日，星期五第8页，共56页，2023年，2月20日，星期五农杆菌的活化第9页，共56页，2023年，2月20日，星期五挑单克隆第10页，共56页，2023年，2月20日，星期五第11页，共56页，2023年，2月20日，星期五第12页，共56页，2023年，2月20日，星期五收集细胞第13页，共56页，2023年，2月20日，星期五用液体MS培养基重悬细胞第14页，共56页，2023年，2月20日，星期五将预培养的外植体放入菌液中侵染第15页，共56页，2023年，2月20日，星期五取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液第16页，共56页，2023年，2月20日，星期五共培养第17页，共56页，2023年，2月20日，星期五第18页，共56页，2023年，2月20日，星期五在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽第19页，共56页，2023年，2月20日，星期五诱导芽生长第20页，共56页，2023年，2月20日，星期五生根，形成转化植株第21页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.2病毒介导法病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体“植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3种:单链RNA植物病毒载体系统,是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA,将其克隆到质粒或粘粒载体上,把外源基因插入到病毒的cDNA部分,通过体外转录,将带有外源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。单链DNA植物病毒载体系统,是由单链环状DNA分子组成,一般存在成对的2个病毒颗粒，这种二连基因组可以把外源基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。双链DNA植物病毒载体系统,是将其病毒基因组中对病毒繁殖非必需的1段核苷酸序列去掉,换上1小段外源DNA而不影响病毒基因组正常包装”用这样重组的病毒载体感染植物细胞以获得外源基因的转移。第22页，共56页，2023年，2月20日，星期五病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机理复杂。目前,用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜在的危害性必须予以足够的重视。第23页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.3DNA直接导入基因转化所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。常用的DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两大类。第24页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.3.1化学诱导DNA直接转化化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有2种方法：PEG介导法和脂质体介导法。PEG介导基因转化脂质体介导基因转化第25页，共56页，2023年，2月20日，星期五PEG介导基因转化PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。PEG通过电荷之间的相互作用,与DNA形成紧密复合物,植物细胞通过内吞作用吸收这些复合物，一般PEG浓度较低时,不会对原生质体造成伤害,而获得的转基因植株。来自同1个细胞,避免了产生嵌合转化体,转化稳定性和重复性好,容易选择转化体，受体植物不受种类的限制。但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用,且转化率低,一般在10-5~10-6。这种方法首先用在模式植物烟草上,转导象Ti质粒那样比较大的质粒。在添加PEG和外源DNA时,人们已成功地将外源基因整合到原生质体基因组,并得到表达，利用原生质体的全能性,目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻，大麦，玉米及一些双子叶植物中获得了转基因植株。第26页，共56页，2023年，2月20日，星期五脂质体介导基因转化脂质体法是用脂类化学包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA分子,然后与植物原生质体共保温,于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用,而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA导入植物的原生质体这种方法具有许多方面的优点：包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。第27页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.3.2物理法诱导DNA直接转化物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学法更具有广泛性和使用性。常用的物理方法有电激法、超声波法、显微注射法和基因枪法。第28页，共56页，2023年，2月20日，星期五电激法介导基因转化电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。第29页，共56页，2023年，2月20日，星期五电击法的转化效率与化学法相似。它除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质的损伤。第30页，共56页，2023年，2月20日，星期五超声波介导基因转化超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使外源DNA进入细胞。操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片，切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml，质粒DNA20μg/ml及鲑鱼精DNA40μg/ml，室温下超声处理30分钟。第31页，共56页，2023年，2月20日，星期五超声波所特有的机械作用，热化作用和空化作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的面积较大等特点，使得转化效率较高。该方法有以下优点，操作简单，设备便宜，不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待进行深入研究，使之完善。第32页，共56页，2023年，2月20日，星期五显微注射介导基因转化显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。转化的成功率高可以省去选择性标记的麻烦第33页，共56页，2023年，2月20日，星期五基因枪法基因枪法又称微弹射击法。其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。在禾本科作物上应用较广泛。第34页，共56页，2023年，2月20日，星期五基因枪转化的操作步骤靶细胞或组织的预处理微粒子弹的制备装备基因枪轰击过渡培养进行筛选培养或直接分化再生植株第35页，共56页，2023年，2月20日，星期五PDS-1000|HeSystem第36页，共56页，2023年，2月20日，星期五第37页，共56页，2023年，2月20日，星期五便携式基因枪第38页，共56页，2023年，2月20日，星期五基因枪法转化的优点有：无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。操作简单快速但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。且形成多拷贝第39页，共56页，2023年，2月20日，星期五3.4花粉管通道法花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。该方法是有我国科学家周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中发展起来的。第40页，共56页，2023年，2月20日，星期五微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。第41页，共56页，2023年，2月20日，星期五优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。机理？第42页，共56页，2023年，2月20日，星期五常用植物基因转化方法特点比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围

有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛第43页，共56页，2023年，2月20日，星期五4.植物基因转化系统的选择原则对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法，因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。第44页，共56页，2023年，2月20日，星期五5.转基因植物的检测鉴定进行基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上的外源基因是否表达，这一系列问题仍需回答。只有获得充分的证据后才可以认为被检材料是转基因的。第45页，共56页，2023年，2月20日，星期五5.1转基因植物的检测鉴定方法报告基因的表达检测转基因植物的PCR检测外源基因整合的Southern杂交鉴定外源基因转录的Northern杂交检测外源基因表达蛋白的检测生物学鉴定第46页，共56页，2023年，2月20日，星期五5.2报告基因的表达检测报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。常用的报告基因NPT-II新霉素磷酸转移酶基因抗氨基环醇类抗生素CAT氯霉素乙酰转移酶基因抗氯霉素HPT潮霉素磷酸转移酶基因抗潮霉素GUSß-葡萄糖苷酸酶基因产生蓝色物质GFP绿色荧光蛋白基因产生绿色荧光LUC荧光酶素基因发射光子第47页，共56页，2023年，2月20日，星期五npt-Ⅱ活性检测目的：检测Npt-Ⅱ基因在植物组织中的表达原理：Npt-Ⅱ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时使用放射性标记的[Ύ-32P]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移，生成放射性的卡那霉素来检测。检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法Npt-Ⅱ提取物+[Ύ-32P]ATP→32P磷酸化的卡那霉素→放射自显影第48页，共56页，2023年，2月20日，星期五cat基因活性检测原理：cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，可生成1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、1,3-二乙酰氯霉素三种乙酰化产物。乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。cat基因活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素的生成来测定，常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。第49页，共56页，2023年，2月20日，星期五gus基因的检测gus基因编码ß-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解。检测常用底物有3种：

5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）

4-甲基伞形酮酰-ß-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）对硝基苯-ß-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）检测方法：组织化学染色定位法荧光法测定GUS活性分光光度法测定GUS活性第50页，共56页，2023年，2月20日，星期五gfp基因的检测绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表