生化2蛋白质课件

1.掌握蛋白质化学组成和分类；2.掌握氨基酸分类、结构、和分离分析方法，氨基酸的两性性质，pI和Pk，重要化学反应；3.弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法；了解二、三和四级结构基本概念；4.了解蛋白质的生物功能、重要理化性质；5.了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据；6.了解结合蛋白的分布、特性和生物功能。第二章蛋白质

蛋白质是各种氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的含氮的生物大分子，是生命存在的形式。蛋白质存在于所有的生物细胞中，是动植物和微生物细胞中最重要的有机物质之一，是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。2.1蛋白质的分类4/10/2023一、蛋白质的重要作用1.生物催化作用（酶）2.结构物质(生物膜、结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3.物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）4.运动功能(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白)5.贮存功能（卵清蛋白、种子蛋白、铁蛋白等）6.防御、免疫作用(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白)4/10/2023二、蛋白质组成与分类1.化学组成(1)元素组成:主要组成元素为碳、氢、氧、氮;有的还含有少量的硫、磷、碘或金属元素（如铁、铜、锌等）。其中，C占50～

55%，H6～

8%，O20～

23%，N15～

18%，S0～

4%。大多数蛋白质的N含量约为16%。

凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白含氮量×6.25(2)氨基酸组成蛋白质是由20种基本氨基酸组成的长链分子，这些氨基酸中，大部分属于L--氨基酸；脯氨酸属于L--亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸。4/10/20232.蛋白质的常见分类方法(1)根据蛋白质的分子组成

简单蛋白质和结合蛋白质

清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶谷蛋白组蛋白鱼精蛋白硬蛋白①简单蛋白②结合蛋白核蛋白脂蛋白糖蛋白和粘蛋白磷蛋白色蛋白:血红蛋白黄素蛋白金属蛋白根据溶解度的不同根据非蛋白质即辅基的不同4/10/2023类别特点及分布举例

简单蛋白质清蛋白溶于水，加热即凝固。需饱和硫酸铵才能沉淀。广泛分布于一切生物体中血清清蛋白、乳清蛋白球蛋白不溶于水，溶于稀盐溶液，需半饱和硫酸铵沉淀。分布普遍血清球蛋白、肌球蛋白、大豆球蛋白等谷蛋白不溶于水、醇及中性盐溶液，易溶于稀酸或稀碱，受热不凝固。各种谷物中米谷蛋白、麦谷蛋白醇溶谷蛋白不溶于水，溶于70％～80％乙醇中玉米蛋白精蛋白溶于水及稀酸，遇热不凝固，是碱性蛋白，含His.Arg多蛙精蛋白组蛋白溶于水及稀酸，不溶于稀氨水，碱性蛋白，含His.Lys多小牛胸腺组蛋白硬蛋白不溶于水、盐、稀酸或稀碱溶液。分布于动物体内结缔组织，毛、发、蹄、角等角蛋白、胶原、弹性蛋白、丝心蛋白等

结合蛋白质核蛋白辅基是核酸。存在于一切细胞中核糖体、脱氧核糖核蛋白体脂蛋白与脂类结合。存在于生物膜和动物血浆中卵黄蛋白、血清-脂蛋白糖蛋白与糖类结合而成,广泛存在于动植物组织中粘蛋白、-球蛋白、膜蛋白等磷蛋白以丝苏残基的-OH与磷酸成酯键结合而成。乳、蛋等生物材料中酪蛋白、卵黄蛋白血红素蛋白辅基为血红素。存在于一切生物体中血红蛋白、细胞色素等黄蛋白辅基为FAD或FMN。存在于一切生物体中琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶等金属蛋白与金属元素直接结合铁蛋白、乙醇脱氢酶(含锌)、黄嘌呤氧化酶(含钼、铁)

乳糜微粒极低密度脂蛋白低密度脂蛋白高密度脂蛋白

CM

VLDLLDLHDL形成部位：小肠粘膜肝细胞血浆、肝肝细胞功能：转运外源转运内源转运内源逆向转运

甘油三酯

甘油三酯

胆固醇胆固醇血浆脂蛋白功能：(2)根据蛋白质分子形状

球状蛋白质和纤维状蛋白质(3)根据蛋白质生物功能

活性蛋白质和非活性蛋白质

活性蛋白质包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子。绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白等。非活性蛋白质对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。2.2蛋白质的组成单位——

氨基酸(Aminoacid)一、氨基酸的结构二、氨基酸的分类三、氨基酸的理化性质四、氨基酸的分离与分析五、氨基酸的制备和应用状况蛋白质是由20种基本氨基酸组成的。1.氨基酸的结构通式:2.α-氨基酸的构型:

构型：指在立体异构体中的原子或取代基团的空间排列关系。不同的空间排列称为不同的构型。（构型的改变涉及到共价键的形成和破坏，但与氢键无关。）

构象:一个分子结构中原子沿共价键转动而产生的不同空间排列。(构象的改变会牵涉到氢键的形成和破坏，但不涉及共价键的破坏。）氨基酸的构型分为D型和L型两种。即都有手性碳原子，在三维空间上两种不同的排列方式，它们互为镜影。它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L－甘油醛（或L－乳酸）构型相同的，就定义为L－氨基酸，反之为D－氨基酸。

生物体内组成蛋白质的AA都是L-型(除甘氨酸以外)。只在少数细菌细胞壁上发现D-型。

脂肪烃基的氨基酸R基均为中性烷基，对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点（6.0±0.03）

Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。从Gly至Ile，R基团疏水性增加。

蛋白质多肽中Gly残基的存在将增加其结构区域的柔性。②R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）a-氨基-γ-硫甲基-丁酸a-氨基-β-巯基-丙酸a-氨基-β-羟基-丁酸SerineThreonineCysteineMethionine

Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理条件下不解离，在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。

Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。★Cys的R中含巯基（-SH），具有两个重要性质：（1）在较高pH值条件，巯基解离。（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。★

Cys与结石：半胱氨酸的强碱溶液是有效的溶石药物★Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。④R中含有酸性基团（2种）Asp、GluAsp侧链羧基pKa为3.86，Glu侧链羧基pKa为4.25它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两种氨基酸。a-氨基-丁二酸a-氨基-戊二酸AsparticacidGlutamicacid⑤R中含碱性基团（3种）a，

-二氨基己酸a-氨基-δ-胍基-戊酸a-氨基-β-咪唑基-丙酸

Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），侧链的氨基反应活性增大。

Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。

His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。

His在酶的酸碱催化机制中起重要作用(3)杂环族氨基酸(1种)(4)杂环亚氨基酸（1种）四氢吡咯-2-羧酸Pro残基的存在将会增加蛋白质结构区域的刚性。ProlineHistidine

2.根据氨基酸R基侧链的极性，可将氨基酸分为：疏水性氨基酸（非极性氨基酸）亲水性氨基酸（极性氨基酸）不带电荷的极性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸AspGluLysArgHisSerThrTyrAsnGlnCysAlaValIleLeuProMetPheTrpGly胱氨酸非编码氨基酸羟脯氨酸与羟赖氨酸存于纤维蛋白、胶原蛋白及植物细胞壁的糖蛋白中胶原蛋白三、氨基酸的理化性质(一)氨基酸的一般物理性质a-氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。1.熔点:氨基酸熔点较高，一般在200～300°C。2.溶解度:氨基酸的溶解度差别很大，溶于稀酸稀碱，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。3.味感:各种氨基酸有不同的味感:甜、鲜、苦、无味。谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分4.旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+)表示。5.光吸收：

芳香族氨基酸在pH8时紫外吸收光谱（280nm）20种基本氨基酸在可见光区没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。在280nm处，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱。280nm处光吸收的测定，是定量蛋白质浓度最常用的方法。紫外吸收性受溶液pH的影响氨基酸在水溶液和结晶都是以两性离子形式存在。(二)氨基酸的酸碱性质（两性解离）正离子两性离子负离子氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。（1）氨基酸的等电点pI：1.等电点：pI(等电点)：指两性电解质所带正负电荷相等时溶液的pH值。pI是pK1和pK2的算术平均数，即两性离子两侧的基团的pK值之和的一半：pI

=（pK1+pK2）/2例:加入酸或碱使Ala净电荷等于0时的pH值就是丙氨酸等电点。

pIAla=(2.34+9.69)/2=6.02k1k2Ala+Ala+Ala+/Ala±Ala±Ala-Ala±/Ala-2氨基酸的每一功能基团都能被酸碱所滴定，可根据氨基酸的滴定曲线来推算pK值：滴定中点时的pH。（2）氨基酸的可解离基团的pK值。pK值为某个可解离基团、侧链基团的解离常数的负对数。两性离子两侧的pK之和的一半中性的AA：

pI=(pK1+pK2)/2酸性AA:Glu、Asp

pI=(pK1+pKR)/2碱性AA:Arg、Lys、His

pI=(pK2+pKR)/22.AA等电点的计算中性氨基酸：以Gly为例[H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97GlyK1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+]酸性氨基酸，以Asp为例：Asp+Asp-Asp=Asp+碱性氨基酸，以Lys为例：Lys++

结论：

在等电点时，氨基酸主要以两性离子存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。pH=pI时,等电点时的pH

，氨基酸净电荷为零；

pH＞pI时，等电点以上的任何pH，氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动；

pH＜pI时，低于等电点的任何pH，氨基酸带净正电荷，在电场中将向负极移动。在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈多。

1、与茚三酮反应α-氨基酸与茚三酮试剂共热，可发生反应生成蓝紫色化合物(570nm处测定AA的含量)。蓝紫色化合物(三)氨基酸的化学性质氨基酸的化学反应

茚三酮反应与脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成黄色化合物，其结构如下所示：反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量，均可作为氨基酸定量分析依据(440nm处测定脯氨酸和羟脯氨酸含量)。

2、与亚硝酸反应

含游离α-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸。在标准条件下测定生成的N2↑的体积，即可计算氨基酸的量。

VanSlyke氨基氮测定法就是根据此反应原理。蛋白质被水解时，a－氨基不断增多，与亚硝酸反应放出的氮气量也随之增加。而蛋白质所含的总氮量是不变的。因此通过水解过程中的a－氨基氮量的变化以及总氮量的比例关系可以判断蛋白质的水解程度。含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。3、Sanger反应（酰基化）

——与DNFB的反应

2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱溶液中发生亲核芳香环取代反应生成黄色的2,4-二硝基苯基氨基酸（DNP－氨基酸），英国的Sanger用这个反应来鉴定多肽N-未端的氨基酸，从而测定多肽或蛋白质的AA排序。

-NH2上的N是一个亲核中心,能发生亲核取代反应。H原子可被酰基、羟基取代。多肽的人工合成中被用作氨基保护。DNFBDNP-氨基酸（黄色）2,4-二硝基苯基氨基酸α-氨基酸与异硫氰酸苯酯(PITC)（苯异硫氰酸）在弱碱条件下形成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-氨基酸)

（苯异硫氰氨基酸），与酸发生环化生成苯硫乙内酰脲（PTH）。

这是著名的Edman降解，进行多肽链N-未端氨基酸的测定。

现在根据此原理设计出了“蛋白质顺序测定仪”。4、Edman反应

——与苯异硫氰酸（酯）的反应

与苯异硫氰酸（酯）的反应PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸异硫氰酸苯酯苯异硫氰氨基酸苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物层析法分离后显色，多肽链N-未端氨基酸的测定氨基乙内酰苯硫脲5、与丹黄酰氯的反应:

氨基酸与5一二甲氨基萘磺酰氯（简称丹黄酰氯，dansylchloride,或用DNS-Cl表示）反应，生成丹黄酰氯的衍生物。具有很强的荧光，可用于微量分析或肽链氨基末端氨基酸顺序分析。

6、与甲醛反应：氨基酸在溶液中有如下平衡：甲醛滴定法：NH3+是一个弱酸，完全电离是的pH约在12～13，用一般的指示剂很难准确判断其滴定的终点，一般不能直接用酸碱滴定法来定量测定氨基酸。在中性pH和常温下甲醛能很快与氨基酸的a-氨基结合，产生羟化物。羟基诱导电子使氮上的电子密度降低，氮不再吸引质子，质子游离出来，使平衡向右移动，促使NH3+释放出质子，使溶液酸性增加，滴定的终点移动到pH9左右，这时可用酚酞作指示剂，用氢氧化钠滴定。每放出一个质子就相当于一个氨基酸。二羟

甲醛滴定法不仅用于测定氨基酸含量，也常用来测定蛋白质水解程度。

7、与荧光胺反应

氨基酸可与荧光胺反应，产生荧光产物，可用荧光分光光度计测定氨基酸含量。AA的

α-羧基：

成盐和成酯反应：在HCl（干燥）存在下与无水甲醇（乙醇）作用即生成氨基甲酯（乙酯）（保护羧基，突出氨基）。氨基酸与NaOH反应即得到氨基钠盐。脱羧基反应:

AA在生物体内经AA脱羧酶作用，放出二氧化碳并生成相应的一级胺。成酰胺反应:

AA与氨作用可形成氨基酸的酰胺，为生物体储NH3的主要反应。动、植物体内的Gln、Asn可以由这种反应形成。成肽反应:α-羧基、α-氨基侧链R基参加的主要反应:

-SH的氧化还原;酚基的Millon反应(Tyr+米伦试剂产生红色);Folin一酚反应(Tyr或Trp+磷钼酸

蓝色)等1.纸层析法：分配系数2.薄层层析法：定性。原理因所用薄层的原料而不同。用氧化铝等吸附剂则是吸附层析；若用纤维素或硅藻土则属分配层析3.离子交换柱层析法：电荷

5.纸电泳

四、氨基酸的分离与分析在蛋白质组成分析、氨基酸顺序分析，水解制备氨基酸或微生物发酵生产氨基酸时要进行氨基酸的分离、分析和纯化。主要根据被分析样品的（如aa混合物）分配系数、所带电荷、分子大小等不同而达到分离的目的

：4.高效液相层析法：电荷、分配系数柱固定相装于柱内纸固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜与纸层析相似，纸用其它高分子有机吸附剂代替层析按支持物分：吸附固体吸附能力不同分配液体分配系数不同离子交换离子交换剂亲和性不同凝胶多孔凝胶通过速度不同亲和固定相只能与一种组分结合，——分开其它无亲和力的组分固定相各组分对固定相按层析原理分：分配柱层析

填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮显色定量。纸层析：固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开。

单向纸层析图Rf值

薄层层析：将有适当粘度的固定相涂在薄板上

离子交换层析

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。

阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H强酸型），羧基-COOH（弱酸型）阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-

离子交换层析高效液相层析（highperformance(pressure)liguidchromatography,HPLC）HPLC的特点:HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol水平固相支持物颗粒小，比表面积大溶剂系统采用高压，洗脱速度快适于各种类型的支持物的柱层析HPLC常用的层析柱：反相柱和正向柱两种

五、氨基酸的制备

氨基酸在生物体内具有重要的生理功能：组成蛋白质；充当化学信号分子：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质；甲状腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素；许多含N分子的前体物：含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要AA；是重要的代谢中间物：精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸是尿素循环的中间物；特殊的生理作用，参与代谢作用，治疗疾病；用于食品加工：强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂；饲料添加剂；调节皮肤pH和保护皮肤的功能。

制备氨基酸有4种途径：从蛋白质水解液中分离提取；应用发酵法生产；应用酶的催化反应生成氨基酸；有机合成法。适宜于中小规模的生产可大规模生产2.3肽肽的基本概念肽命名动植物体内重要的肽——谷胱甘肽（简称GSH）肽类的应用和发展前景一、肽的基本概念1.肽:一分子氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物叫做肽。蛋白质是多个氨基酸分子通过酰胺键（蛋白质化学中将这类酰胺键专称为肽键）连接而成的生物大分子。肽键

-CO-NH-＊肽键的特点：是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。在细胞内环境条件下，肽键相对稳定2.几个相关的概念氨基酸残基(aminoacidresidue)：

多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。肽链中的氨基酸不是原来完整的分子。二肽，寡肽与多肽：二肽(dipeptide)：由两个氨基酸残基组成的肽。寡肽(oligopeptide)：由十二个以上二十个以下氨基酸残基组成的肽多肽(polipeptide)：由多个氨基酸组成的肽，亦称多肽链。多肽链肽键链状结构肽键链状结构N端氨基酸残基氨基酸残基C端肽链书写方式：N端→C端注：肽链可以是链状、环状或分支状。

N-端与C-端：

多肽链中含有游离-氨基的一端，称为氨基酸的氨基端或N-端；含游离-羧基的一端，称为氨基酸的羧基端或C-端。

氨基酸顺序：

在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序，氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。上述五肽可简写表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln肽链的表示法(简写)多肽与蛋白质

蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。二、肽命名

多肽化合物的名称，通常按照肽内氨基酸残基的排列顺序，以残基名称（如某某氨酰）从N端依次阅读到C端，并以C端残基全名结束肽的名称。下列五肽命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸：氨基末端羧基末端注意：在开链肽的N端和C端可以有游离的α氨基和α羧基，而有的开链肽的N端或C端的游离的α氨基或α羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残基自身环化。

例如促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（α-氨基与谷氨酸的γ-羧基脱水缩合而成）。举例1.谷胱甘肽

由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成

它的分子中有一个特殊的γ肽键，是由谷氨酸的γ羧基与半胱氨酸的α氨基缩合而成。由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键(disulfidebond,disulfide

bridge)相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）。（glutathione）三、生物活性肽（BAP）

氧化型谷胱甘肽用代号G-S-S-G表示

2G-SH=G-S-S-G谷胱甘肽重要的生物功能谷胱甘肽的主要生理功能是抗自由基，抗衰老，抗氧化。谷胱甘肽不仅能消除人体自由基，还可以提高人体免疫力。它不但能增进血球，制造保护物质的功能（能保护身体免受感染的物质），也能降低体内由细胞发炎物质的总含量。谷胱甘肽在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大。美国著名营养保健专家艾尔·敏德尔博士称谷胱甘肽为三倍效能的抗衰老氨基酸。维护蛋白质活性中心的巯基。谷胱甘肽可阻止氧化血红蛋白，保护酶分子中-SH基，有利于酶活性的发挥，并且能恢复已被破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶重新恢复活性。谷胱甘肽还可以抑制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。中和解毒作用。谷胱甘肽能与进入人体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进其排出体外。谷胱甘肽对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状，有强有力的保护作用。谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用。谷胱甘肽可作为治疗白内障药剂的主要成分。近年来，西方科学家，尤其是日本学者发现谷胱甘肽也具有抑制艾滋病毒的功能。谷胱甘肽是孕妇的必需营养补充剂，它关系到婴儿的体内发育生长。研究表明，有些孕妇身体虚弱缺乏蛋白质，主要是缺乏谷胱甘肽。可作食品添加剂。加入到面制品中，可起到还原作用。不仅使制造面包的时间缩短至原来的二分之一或三分之一，劳动条件大幅度改善，并起到食品营养的强化作用及其他功能；将其加入到酸奶和婴幼儿食品中，相当于维生素C，可起到稳定剂的作用；将其拌到鱼糕中，可防止色泽加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。2.肌肽和鹅肌肽：新型抗氧化剂肌肽（carnosine）:β-丙氨酰-L-组氨酸，是一种天然的水溶性二肽，以较高浓度存在于有氧代谢最活跃的部门—肌肉和脑中。在脊椎动物骨骼肌中，肌肽的含量约为1.6～20.6µmol/g,且白肌纤维中的含量比红肌纤维中的高。肌肽在猪肉、牛肉和鸡肉中的含量分别为4.8，2.0，和15.0mM，在人体肌肉中的含量为2～20mM。肌肽类生物活性肽是一类重要的神经递质，具有调节酶的活性以及螯合重金属等重要生物学功能,对老年性白内障的治疗以及受伤肌肤的康复都有独特作用。研究还发现肌肽可以抑制体内由铁、血红素蛋白、脂肪氧化酶等催化的氧化反应，还能阻碍蛋白质羰基化及糖化反应。在医药与化妆品行业将有很好的发展前景疲劳和产后喝鸡汤，鸡汤中也可以走出药物来。3.多肽激素

种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。使乳腺和子宫的平滑肌收缩促进血管平滑肌收缩

1986年的诺贝尔生理学奖颁给了发现多肽生长因子（NGF）的StanleyCohen，表彰他为基础科学研究开辟了一个具有广泛重要性的新领域。多肽是体现信息的使者，是引起各种各样的生理活动和生化反应的调节者。多肽生物活性高，1×10－7mol／L就可以发挥活性，就是说1mL的多肽用一火车皮的水来溶解都仍然具有活性。如1928年发现的胆囊收缩素，在千万分之一含量时仍然对胆总管有明显的收缩作用。

分子小，易于结构改造，相对于蛋白质而言较易人工化学合成。被称之为中国生化第一技术的人工合成胰岛素就是一种51肽。存在于生物体的多肽已有数万种，并且发现所有的细胞都能合成多肽。同时，几乎所有细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。21世纪是一个多肽的世界。

四、肽的应用及发展多肽有多种功能，可以制成多种成品补充人体，具体如下：

1、现代免疫新品：生物活性多肽（小肽），如“非典”中发挥重要作用的“三九蛋白肽”，具有强化人体免疫功能，起到过去肽类药品对付现代病毒所取不到的功能。它可抗菌、抗现代病毒，阻止SARS细胞进入人体后，可模仿病毒表面的蛋白质论断，与病毒进行“竞争”，从而阻断病毒感染细胞的途径。因此，这种多肽是现代病毒的克星，是现代免疫的上品。这种多肽还具有刺激巨噬细胞的吞噬能力，抑制肿瘤细胞生长的作用。

已获广泛应用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T细胞的分化。近年来在日本以及中国已开始使用糖肽辅助治疗肿瘤，其作用机理就是使淋巴系统活化。用于抵抗微生物的环孢菌肽，具有杀真菌和抗炎性质。未来的抗菌肽将不同于传统的抗菌素，其作用专一，能从核酸和基因的角度去发挥作用。

2、神经肽可起到镇痛及调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温的作用，与普通镇痛剂不同的是，它经过消化器官进入人体后无任何副作用。

神经系统中，神经肽是人和动物生长和激素调节的重要物质。例如：神经紧张肽（NT）能降低血压，对肠和子宫还具有收缩作用，它能在不影响生长激素或促甲状腺素释放的情况下增加黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌；内啡肽与脑啡肽的衍生物有着很强的镇痛作用；1975年Monnier发现的催眠肽（DSIP）是唯一没有副作用的多肽，在高节律、高度紧张的社会中，睡眠不正常人群正在扩大，DSIP将是最好的选择。

3、在人体其他系统，多肽同样发挥着巨大的作用：

降血压肽，实现降压功能，治疗高血压。1983年Bolel等从鼠心肌的血浆中分离到心房肽ANP，在抗人类高血压疾病、抗水肿中，ANP可以改变人们传统的治疗思想。降钙肽通过刺激骨形成细胞引起磷酸钙在骨架上的沉降，可以有效治疗骨萎缩。

促甲状腺素释放激素（TRH）是一种能促进产妇乳汁分泌的多肽。促性腺激素（LHRH）是一种能刺激女性的黄体分泌，引起排卵并促进雌性激素合成。环状的14肽（SST）能治疗糖尿病、胃溃疡、胰腺炎。生长激素（STH）或人体生长激素（HGH）是一种线型多肽，能治疗侏儒症。发现于70年代的促肾上腺皮质激素（ACTH）是24肽，在治疗风湿关节病、支气管哮喘和肾病中都有相当的价值。临床上常用的催产素也是一种多肽。对于从事商业和科技工作的人来说，DBI衍生肽是一种最好的精神舒缓肽。多肽与健康

WHO在新千年之前呼吁：“21世纪人类最大的疾病是生活方式的疾病”，多肽在改善和调整人们的生活方式方面将发挥极大的作用。也许将来有一天，早上我们服用添加了维生素的多肽，为我们一天的工作提供旺盛的精力；中午伴着简单的工作餐服用全面营养多肽，均衡我们的营养；面对高脂肪、高蛋白、高热量的丰盛晚餐，我们服用降脂肽、胃肠满足肽，既解决对美味的渴望，又不会使我们不知节制；入睡前就着牛奶把睡眠肽送下，好梦连连。假日当你和朋友一起运动后，服下少许轻松肽让你迅速消除疲劳；面对备考紧张的学子，母亲会送给他一盒甜甜的巧克力肽糖；在电脑前留连的网虫，口里嚼着能抵抗荧屏幅射的多肽香口胶，畅游在因特网上；爱美的女孩，多肽营养霜和面膜可以帮你留住青春；风采动人的少妇，抗衰肽可以使你魅力永驻；秋高气爽的重阳节，乐龄人（国内称老龄人）口含多肽人参片登高远行气不喘；商场激战的巨子、政坛高论的政客，需要激情和理智，神怡多肽让你上九天揽月，下商海捞金；美美的一杯激情肽定让幸福的夫妻更美满……这一切并不是科学家的幻想，而是正在走进你我的多肽世界。2.4蛋白质的结构

每种蛋白质分子在其天然状态都有一定的三维结构称为构象。纤维蛋白：球蛋白：一级结构二级结构三级结构四级结构据构象据结构水平

是动物结缔组织的基本结构成分，坚韧，不溶于水和稀盐溶液。多肽链折叠成紧密球状，大多溶于水，具有多种功能。如，酶、激素、血红血清蛋白（运转）据结构水平介于二者之间，如，肌球蛋白一、蛋白质分子的一级结构是指氨基酸在肽链中的排列顺序及二硫键的位置，是多肽链具有共价键的主链结构。二硫键

蛋白质的种类和生物活性都与肽链的氨基酸种类和排列顺序有关，蛋白质的一级结构决定了其二级和三级结构，其三维结构所需的全部信息也都储存于氨基酸序列之中。肽键(peptidebond)和二硫键(disulfidebond)均属于蛋白质一级结构

二、蛋白质的二级结构天然的蛋白质分子并不是一条走向随机的松散肽链，每一种都具有自己特定的空间结构。线性的多肽链在空间中折叠成特定的三维空间结构通常称为蛋白质的高级结构或分子构象。蛋白质的二级结构：是指蛋白质分子中的多肽链中相邻氨基酸残基之间由于氢键相互作用而形成的有规则、重复排列的空间关系。是蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，包括α螺旋、β折叠和β转角等。肽键不能自由转动，具有部分双键性质。酰胺平面，也叫肽平面(六个原子处于同一个平面)，多为反式。X射线衍射法测定蛋白质化学结构的键长、键角肽键的键长和键角肽键的键长0.133nm，介于C=N（0.127）和C-N(0.143)之间。1.多肽主链的基本结构在肽链中每6个原子C-C(=O)-N(-H)-C构成一个肽单元，两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转（1）肽单元(酰胺平面或肽键平面)（2）二面角的定义φ角—绕Cα-N键旋转的角度ψ角—绕Cα-C键旋转的角度连接在同一个C原子上的两个肽键平面处在同一平面时定义

和均为零度)

二面角可以在00—+1800范围内变动。通过二面角的旋转，多肽链可以形成各种各样的折叠方式。从N端看去，以顺时针相1800方向旋转的角度用“+”表示；逆时针时则为“-”。肽链的所有的可能构象都能用φ角和ψ角这两个构象角（二面角）来描述2CNαC（3）二面角决定肽链的构象

肽链中φ和ψ这一对二面角决定了相邻的两个酰胺平面所有原子在空间上的相对位置，就决定了肽链的构象。注意二面角（φ、ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子之间的接近有无障碍。（1）α-螺旋结构

（α-helicalStructure）左右手螺旋结构螺旋结构表示法SNα-螺旋是多肽链主链的螺旋结构中最为常见的结构，也是最稳定的螺旋式结构。

是指多肽链主链环绕螺旋中心轴每隔3.6个氨基酸残基上升一圈而形成的螺旋式结构。

其中，S——螺旋每上升一圈的氨基酸残基数；N——氢键封闭的环本身的原子数，如，3.613螺旋。2.二级结构的基本构象α螺旋主要的结构特点右手型α螺旋结构模型多肽链主链环绕螺旋中心轴螺旋式地上升，每3.6氨基酸残基上升一圈(0.54nm)；螺旋上升时,每个氨基酸残基沿轴旋转100°,向上平移0.15nm；每个φ角为-57°，每个ψ角为-47°；每个基酸残基上的亚氨基和位于它前面的第4个基酸残基上的羰基形成氢键；氨基酸残基的R基团从α螺旋伸出，不在圈内。俯视图Pauling于1951年提出，多肽主链构象，一种周期性的肽结构；若干条肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列；相邻肽链之间或同一肽链内平行肽段之间依靠＞C=O和＞NH的氢键维持；折叠的片层结构避免了R基团的空间障碍，与Cα相连的R基团交替位于上、下方，并与片层垂直。

β折叠的多肽链几乎完全伸展。（2）β折叠结构（β–platedstructure）β折叠结构（β–platedstructure）平行β折叠a）反平行β折叠b）β凸起

β凸起（β-bugle）是一种小片的非重复性结构，能单独存在，但大多数经常作为反平行β折叠片中的一种不规则情况而存在。β凸起可认为是β折叠股中额外插人的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在凸起折叠股上是两个残基。而另一侧的正常股上是一个残基。

图为典型的β－凸起。造成凸起股主链额外残基之所以被规则的氢键网所容纳，部分原因是凸起股产生微小的弯曲。因此β－凸起引起多肽链方向的改变，但改变程度不如β－转角。

转角或回折结构是使肽链构象的走向发生改变的结构称回折结构。蛋白质分子中有可以将不同的二级结构连接起来，组装成更高层次构象的一些转弯结构。在球蛋白分子中，回折结构很多，有利于多肽链反复折迭，组成结构较紧密的球状蛋白。甘氨酸和脯氨酸常出现在回折结构的转角部位。在球蛋白分子中，常见的回折结构有两种，即β-转角与γ-转角。（3）转角（bend）或回折结构(reverseturn)

β-转角是连接蛋白质分子α-螺旋和β-折叠，一般含有2～16个氨基酸残基。特点是：第1个氨基酸残基羰基氧与第4个残基的酰胺氮之间形成氢键。

γ-转角与β-转角不同点是多肽链回折的方向在第三个残基上，而非第四个残基上。因此，它只需三个氨基酸残基，靠两个氢键即可形成γ-转角构象。

转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连接，它对于确定肽链的走向起着决定性的作用。β转角γ转角各类氨基酸与蛋白质二级结构关系（4）无规卷曲(randoncoil)

多肽链主链不规则随机盘曲形成的构象。无规卷曲与生物活性有关，对外界理化因子极为敏感。3.超二级结构（super-secondarystructure）

超二级结构是指二级结构的基本结构单位（α螺旋、β折叠等）相互聚集，形成有规律的、能充当三级结构的构件的二级结构的聚集体（blockbuilding

）或组合体。三级结构的构件

ααβαβββ

β折叠桶

α螺旋-转角-α螺旋①αα

αα是一种α螺旋束，经常是由两股平行或反平行排列的右手螺旋段相互缠绕而成的左手卷曲螺旋或称超螺旋。

左手卷曲螺旋是纤维状蛋白质如α－角蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件，也存在于球状蛋白质中。超螺旋的稳定性主要是由于非极性侧链间的范德华力造成的。三股螺旋又称胶原螺旋、超螺旋

在胶原纤维中，胶原蛋白分子单位称为原胶原(tropocollagen)。每个原胶原分子由三条α－肽链组成，α－肽链自身为α螺旋结构，三条α－肽链则以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构(图)。胶原蛋白的三股螺旋胶原多聚体三螺旋轴的C端投影图

②βαβ

最简单的βαβ组合也称βαβ单元是由两段平行β折叠和一段作为连接链(connector)的α螺旋或无规卷曲组成。Rossmann折叠

最常见的βαβ组合是由三段平行的β股和两段α螺旋构成(右图)，相当于两个βαβ单元聚集体连在一起，称Rossman折叠(βαβαβ)。由于L-氨基酸的伸展多肽链(β链)倾向于采取右手扭曲结构，因此几乎所有实例中连接链都是右手交叉，这是一种拓扑学现象。③ββ

ββ就是反平行β折叠片在球状蛋白质中由一条多肽链的若干段β折叠股反平行组合而成，两个β股之间通过一个短回环(发夹)连接起来。最简单的ββ折叠形式是β发夹(β－hairpin)结构，由几个β发夹可以形成更大更复杂的折叠片图案，如β曲折和希腊钥匙拓扑结构。

β曲折(β－meander)是种常见的超二级结构，由氨基酸序列上连续的多个反平行β折叠股通过紧凑的β－转角连接而成，含有与α螺旋相近数目的氢键，稳定性高。

希腊钥匙拓扑结构(Greekkeytopology)也是反平行β折叠片中常出现的一种折叠形式，这种拓扑结构有两种可能的回旋方向，但实际上只存在其中一种。当折叠片的亲水面朝向观察者时，从N到C末端回旋几乎总是逆时针的。A.β迂回B.希腊钥匙C.双希腊钥匙β曲折和希腊钥匙（回形）拓扑结构A

αα；Bβαβ单元；C

Rossman折叠：α螺旋处于β折叠片上侧；D

β发夹；Eβ曲折；F

希腊钥匙拓扑结构

β折叠桶

反平行β折叠桶β折叠桶的各种形式④α螺旋-转角-α螺旋由两个α螺旋组成的同型二聚体；两个α螺旋之间被一段转动的肽隔开；一个螺旋为识别螺旋，负责识别DNA大沟的特异碱基序列。另一个螺旋没有碱基特异性，与DNA磷酸戊糖链骨架接触。A.噬菌体λB.噬菌体P22

螺旋—转角—螺旋最初是在λ噬菌体的阻遏蛋白中发现的一种DNA结合结构域（domain）。在阻遏蛋白氨基端有5段α螺旋，每段螺旋之间折转成一定角度相连接，其中两段负责同DNA结合。螺旋3由9个氨基酸组成，螺旋2由7个氨基酸组成的。两者形成一个角度。α螺旋3通过氨基酸侧链和DNA碱基之间的氢键与DNA序列相结合，3个氨基酸识别3个碱基，是识别螺旋(recognitionhelix)。α螺旋2则是通过氢键同DNA的磷酸骨架相接触。这种相互作用对于同DNA结合是必需的，但并不控制对靶序列识别的专一性。三、结构域（domain）结构域定义：

蛋白质在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区。通常由100-200个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能，如结合小分子。一条多肽链在结构域范围内来回折叠，但相邻的结构域常被一个或两个多肽片段连结。

对那些较小的球状蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构是一个意思，也就是说这些蛋白质或亚基是单结构域如红氧还蛋白等；较大的蛋白质分子或亚基其三级结构一般含有两个以上的结构域，即多结构域的，其间以柔性的铰链（hinge）相连，以便相对运动。结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分。一般,功能域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位。功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。

从动力学的角度来看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。从功能的角度来看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。木瓜蛋白酶内的2个结构域彼此很不相同弹性蛋白酶的二个结构域彼此非常相似四、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指多肽链中相距较远的氨基酸残基之间的相互作用而使多肽链弯曲或折叠形成的紧密而具有一定刚性的结构，是具二级结构或超二级结构的多肽链进一步折叠、卷曲形成的复杂的球状分子结构。肌红蛋白的三级结构磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构五、蛋白质的四级结构由两条或两条以上各自独立具有三级结构的多肽链通过次级键相互缔合而成的蛋白质结构。

蛋白质四级结构的定义维持蛋白质四级结构的内聚力与维持三级结构的力相同六、维持蛋白质分子构象的化学键氢键、疏水键、范德华力、盐键、二硫键范德华引力或范氏力：聚集物质中分子间存在的一种较弱的作用力，一般只有每摩尔几千焦至几十千焦，比化学键的键能小1～2个数量级。由三部分组成：①当极性分子相互接近时固有偶极将同极相斥而异极相吸，产生分子间的取向力。偶极矩越大，取向力越大。②当极性分子与非极性分子相互接近时，非极性分子在极性分子的固有偶极的作用下发生极化，产生诱导偶极，然后诱导偶极与固有偶极相互吸引而产生分子间的诱导力。当然极性分子之间也存在诱导力。③非极性分子之间，由于组成分子的正、负微粒不断运动，产生瞬间正、负电荷重心不重合，而出现瞬时偶极之间的色散力。分子量越大，色散力越大。当然在极性分子与非极性分子之间或极性分子之间也存在着色散力。范德华引力不具有方向性和饱和性，作用范围在几百个皮米之间的力。它对物质的沸点、熔点、气化热、熔化热、溶解度、表面张力、粘度等物理化学性质有决定性的影响。2.5蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构决定高级结构1.核糖核酸酶（124个氨基酸残基）的变性与复性

——构象改变，活性丧失8mol/Lde尿素+巯基乙醇二、蛋白质结构与功能的关系蛋白质的结构与功能是高度统一的关系。透析2.镰刀型红细胞贫血的分子基础

——组成变化导致结构变化，引起功能异常镰刀型红细胞贫血的分子基础HbA:Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys……HbS:Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys……β链12345678结果：负电荷的Glu变为疏水性的Val，使HbS分子表面的负电荷减少，亲水基团变为疏水基团，使HbS分子聚合，溶解度降低，红细胞变形，呈镰刀状，并易于破裂溶血。治疗：体外，KCNO(氰酸钾,potassiumcyanate)共价修饰β链N端Val残基，使亲水性增加，可防止HbS分子间的缔和

两种以血红素为辅基并能与氧分子可逆结合的蛋白质。血红蛋白的功能是将大气中的氧输送给机体；肌红蛋白的功能则是贮存氧气，当机体需要时可使氧在肌肉内很容易地扩散，释放。肌红蛋白存在于肌细胞中，是单体。血红蛋白主要存在于脊椎动物血液的红细胞中，是四聚体分子。3.血红蛋白与肌红蛋白

——结构和功能相一致

血红蛋白肌红蛋白肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线氧饱和度大气内氧分压PO2

肌红蛋白和血红蛋白的生理功能依赖于血红素辅基可逆地结合氧。由氧合曲线看出：肌红蛋白对氧的亲和性高一些，肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异形成了一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。肌红蛋白——双曲线，而血红蛋白——S形曲线。每个肌红蛋白分子仅有一个O2的结合位置，每一肌红蛋白分子和O2的结合均是独立的。血红蛋白分子每一亚基均有一个O2的结合位置，四个亚基协同作用。2.6蛋白质的性质与分离分析技术一、蛋白质的性质1、蛋白质的相对分子质量

（1）根据化学组成测定最低分子量：用化学分析方法测出蛋白质中某一成分的含量，则

蛋白质的最低分子量=某成分的分子量/某成分含量/某成分数量。（2）渗透压法：当蛋白质浓度不大时：M=RT/lim(∏/C)浓度单位g/L。（3）超速离心法：M=RTS÷D(1－Vρ)其中S是沉降系数，D是扩散系数，ρ是溶剂的密度，V是蛋白质的偏微分比容。（4）SDS法：用已知分子量的标准蛋白求出未知蛋白的分子量。

蛋白质相对分子质量=氨基酸的平均分子质量（a）×氨基酸数—18（氨基酸数-肽键数n）某蛋白质有n条肽链组成，氨基酸的平均相对分子质量为a，控制该蛋白质合成的基因含b个碱基对，则该蛋白质的相对分子质量最多为？有b个碱基对，则有b/3个氨基酸，所以所有氨基酸质量为(b/3)a，因为有n条肽链，所以形成(b/3-n)个肽键，生成每个肽键同时脱去一分子水，所以蛋白质的相对分子质量为：(b/3)a-18(b/3-n)化简得：18n+(a/3-6)b

已知某多肽链相对分子质量为10320，每个氨基酸平均相对分子质量为120，每个脱氧核苷酸的平均相对分子质量为300。那么合成该多肽化合物的基因的相对分子质量约为A.12120；B.90900；C.181800；D.170928。2个氨基酸缩合,就要丢失1分子的水(H2O)，而水的分子量是18，那么假设这条多肽有X个氨基酸，列方程得到:120X-18(X-1)=10320，X=1013个核苷酸(密码子)编码1个氨基酸，因此编码该多肽的核苷酸有101×3=303(个)，而核苷酸的分子量为300，则303×300=90900因为是单链编码氨基酸的，所以合成该多肽化合物的基因的相对分子质量大约是90900×2=1818002、蛋白质的酸碱性质蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

蛋白质等电点：当蛋白质颗粒上正负电荷数目相等时溶液的pH值。处于等电点时的蛋白质在电场中不发生移动；处于等电点时的蛋白质溶解度最低。

电泳：利用带电粒子在电场中移动的方向和快慢的不同进行组分分离的技术。电泳3、蛋白质的变性

蛋白质变性（proteindenaturation）：蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失的现象。（1）可逆变性：如果变性条件不剧烈，变性作用是可逆的，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性的现象称为蛋白质复性。如：盐析、乙醇沉淀（2）不可逆变性：如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。重金属盐（Hg+

Ag+Cu2+）;生物碱试剂（鞣酸、苦味酸、磷钨酸）。蛋白质变性的应用价值：1、分离提纯：盐析2、灭菌、消毒：细菌、病毒加温，加酸、加重金属（汞）因蛋白质变性而灭活3、临床分析诊断：外科凝血，止血；尿中管型诊断肾脏疾病。4、解毒：蛋白质分子结合重金属5、加工业：制革，使皮革成形；蚕丝是由蛋白质变性而成。6、食品业：加入电解质使蛋白质凝聚脱水如做豆腐；酶类分解各种蛋白质，以利于肠壁对营养物质的吸取；鸡蛋、肉类等经加温后蛋白质变性，熟后更易消化。7、制药：从血液中提分离、提纯激素；很多毒素是动物蛋白质，加甲醛固定，减毒、封闭毒性碱基团作类毒素抗原，制作抗毒素。4、胶体性质蛋白质不能透过半透膜，用透析法可进行分离纯化。5、蛋白质的沉淀反应

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，用一定的理化因素处理可破坏蛋白质颗粒表面的水化膜或中和表面电荷而使蛋白质沉淀。（1）可逆的沉淀反应

：蛋白质分子不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。——提纯蛋白质

（2）不可逆的沉淀反应

：蛋白质分子变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

1.中性盐：如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质产生沉淀。可逆沉淀反应盐析：加盐使蛋白质沉淀析出的现象称。分段盐析：不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。2.有机溶剂：如酒精、丙酮等有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。可逆沉淀反应3.重金属盐：如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。不可逆沉淀反应4.有机酸：如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。不可逆沉淀反应5、加热：不可逆沉淀反应6、颜色反应－－蛋白质的定量测定的依据

蛋白质的颜色反应原理：蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。

（1）双缩脲反应（碱性硫酸铜

）紫红色

将尿素加热到180℃，两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生紫红色络合物。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此能发生双缩脲反应。定性、也可定量（540nm）测定蛋白质。

（2）米伦反应（Hg+浓HNO3）

红色

米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。

（3）黄色反应（浓HNO3）

黄色

含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。(4)茚三酮反应

蓝紫色蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。

(5)乙醛酸反应：乙醛酸缓加浓硫酸两液层间出现紫色环在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应，不含色氨酸的白明胶就无此反应。(6)坂口反应：精氨酸的胍基红色精氨酸分子中含有胍基，能与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来定量测定精氨酸含量。（7）福林反应：蓝色蛋白质中酪氨酸含有酚羟基，能使福林试剂在碱性条件下还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。（8）Pauly反应：棕红色组氨酸的咪唑基与重氮苯磺酸生成棕红色化合物7、蛋白质含量测定含量测定生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物中碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨（在凯氏瓶内完成）。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中（在凯氏蒸馏装置中进行）。根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。本法适用范围0.2~1.0mg氮。相对误差应小于2%，干扰少。但

灵敏度低费时长8～10h。2、双缩脲法（Biuret法）

紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，20~30min，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不同蛋白质显色相似

。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。3、Folin—酚试剂法（Lowry法）

显色原理与双缩脲方法是相同的，只是Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

灵敏度比双缩脲法高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多，如K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。4、考马斯亮兰法（Bradford法）（1976年）

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，由棕黑色变为兰色。在595nm下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。

优点是：灵敏度高，最低蛋白质检测量可达1mg；测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5～15min左右；干扰物质少。主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。缺点是：各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；仍有少量干扰物质；只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。5、紫外吸收法

蛋白质分子中，TyrTrpPhe残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。紫外吸收法简便、灵敏、快速,5～15min，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。

缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质（核酸）多，故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。另外，蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。二、蛋白质的分离与分析技术1、根据蛋白质的溶解度不同进行分离盐析、等电点沉淀、乙醇沉淀2、根据蛋白质分子大小进行分离透析和超滤、凝胶过滤3、根据蛋白质带电性质进行分离电泳、离子交换层析4、根据配体特异性进行分离亲和层析凝胶过滤多孔高分子珠离子交换层析亲和层析

浊点萃取法(cloudpointextraction，CPE)是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，不使用挥发